SN 1465-2004西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法.docxVIP

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T1465—2004

西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法

MethodsofquarantineandidentificationofAcidovoraxavenaesubsp.citrulli

2004-11-17发布

2005-04-01实施

中

中华人民共和国

发布

I

SN/T1465—2004

前言

本标准的附录A、附录B为规范性附录，附录C为资料性附录。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准由中华人民共和国新疆出入境检验检疫局负责起草，南京农业大学参加起草。

本标准主要起草人：张祥林、薛光华、胡白石、张伟、范伟功、余永杰。

本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。

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SN/T1465—2004

西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了植物检疫中西瓜细菌性果斑病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrulli,简称A.a.c)的

鉴定方法。

本标准适用于对瓜类植物种子中的西瓜细菌性果斑病菌的鉴定。

2原理

细菌性果斑病(BacterialFruitBlotch)是西瓜、甜瓜等葫芦科作物上的一种危险性病害，此病的病原菌为西瓜细菌性果斑病菌[Acidovoraravenaesubsp.citrulli(Schaad,Sowell,Goth,ColwellandWebb1978)Willems,Goor,Thielemans,Gillis,KerstersandDeLey1992VP],该菌属原核生物界(Procaryotae)、薄壁菌门(Gracilicutes)、暗细菌纲(Scotobacteria)、假单孢菌科(Pseudomonadaceae)、嗜酸菌属(Acidovorax)。该病菌的形态特征、生物学特性、生化特性、寄主范围、传播途径，以及PCR特异

性反应等特征是该检疫鉴定方法的依据。

3仪器和用具

3.1生物显微镜(具照相系统)。

3.2超净工作台。

3.3电子天平(感量1/10000)。

3.4光照恒温培养箱。

3.5恒温振荡培养箱。

3.6低温冰箱。

3.7高压灭菌器。

3.8培养皿(直径：7.5cm)。

3.9恒温水浴锅(30℃~95℃)。

3.10高速冷冻离心机(18000r/min以上)。

3.11小型电动粉碎机。

3.12PCR仪。

3.13电泳装置(电泳仪、水平电泳槽)。

3.14PCR管(0.2mL)。

3.15离心管(12mL、2mL、1.5mL)。

3.16微量可调加样器(2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL)。

3.17加样器枪头(2μL～20μL、20μL～200μL、200μL～1000μL)。

4主要试剂

蛋白胨、琼脂粉、甘油、升汞、盐酸、次氯酸钠、二甲基对苯二胺盐酸盐、酵母膏、葡萄糖、牛肉浸膏、酚红、小蘖碱、羧甲基纤维素、硼酸、亮甲酚蓝、溴甲酚紫、乙醇、放线菌酮、羧苄青霉素、乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基磺酸钠(SDS)、液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、琼脂糖(电泳用)、溴化乙锭、TaqDNA聚合酶、磷酸氢二钾(K?HPO?)、磷酸二氢钾(KH?PO?)、磷酸氢二钠(Na?HPO?·12H?O)、磷酸二氢铵(NH?H?PO?)、硫酸镁(MgSO?·7H?O)、氯化钙(CaCl?·7H?O)、氯

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SN/T1465—2004

化钠(NaCl)、氯化钾(KC1)、10×PCR缓冲液(10mmol/LTris-HCl,10mmol/LKCl)、10×dNTP液

(2.5mmol/LdATP,dTTP,dCTP,dGTP)。

5检疫鉴定方法

5.1种植观察

将待测的瓜类种子种植于温室或实验室内的育苗钵(纸杯或塑料杯)中，每一育苗钵中种植2粒种子，每份种子样品种植5000粒左右，最低不少于3000粒种子，生长环境温度为25℃~35℃,相对湿度大于等于70%,种子出苗后15d内观察幼苗发病情况。如果种植期间有发病幼苗，且表现出西瓜细菌性果斑病苗期的典型症状(见附录A),则采集可疑病株进行分离培养及常规检测，或直接用病叶提取核

酸作PCR检测。

5.2分离培养

5.2.1种