SN 1476-2004鲑鱼肾杆菌聚合酶链式反应操作规程.docxVIP

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T1476—2004

鲑鱼肾杆菌聚合酶链式反应

操作规程

Protocolofpolymerasechainreaction(PCR)for

Renibacteriumsalmoninarum

2004-11-17发布

2005-04-01实施

中华人民共和国

国家质量监督检验检疫总局

发布

I

SN/T1476—2004

前言

本标准的附录A为规范性附录。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：史秀杰、刘荭、高隆英、江育林。

本标准为首次发布的出人境检验检疫行业标准。

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SN/T1476—2004

鲑鱼肾杆菌聚合酶链式反应操作规程

1范围

本标准规定了用聚合酶链式反应技术检测鲜鱼肾杆菌的方法。

本标准适用于鲑鱼肾杆菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究

是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3试剂和材料

3.1Taq酶

一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。

3.2dNTP

含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L。

3.3引物

一对引物，浓度为40μmol/L,序列为：

5-CAAGGTGAAGGGAATTCTTCCACT-3

5-GACGGCAATGTCCGTTCCCGGTTT-3’

扩增鲑鱼肾杆菌中p57蛋白的501个碱基的DNA片断。

3.4无水乙醇

分析纯，使用前预冷到-20℃。

3.5矿物油

要求无DNA酶和RNA酶。

3.6水

实验用水见GB/T6682,其中用于PCR(包括核酸抽提)的水要用DEPC处理，以除去DNA酶和

RNA酶。

4器材和设备

PCR扩增仪、电泳仪、微量移液器及吸头、紫外观察灯、恒温培养箱、普通冰箱、低温冰箱、电动匀浆

器、离心机、离心管、剪刀、镊子。

5取样和制样

5.1取样

取出现坏死病变的肾脏或其他内脏器官。

如果无组织病变，则肾脏为优先采集对象，其次是成熟雌鱼的体腔液或血细胞。鱼卵取卵黄囊膜，

体长小于4cm的幼鱼取整条鱼，体长在4cm～6cm的鱼取包括肾脏在内的所有内脏。

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SN/T1476—2004

5.2制样

在1.5mL的Eppendorf离心管中加入25mg～100mg组织或200pL体腔液，先加入150μLCTAB溶液(见附录第A.1章),剪碎、研磨，再用搅拌器将样品匀浆成糊状。加CTAB到900μL。摇

匀后，25℃作用2.5h。

6鲑鱼肾杆菌核酸的鉴定

6.1DNA抽提

加600μL酚-三氯甲烷-异戊醇(见第A.3章),充分混合30s;12000r/min离心5min,取上层水相；加700μL三氯甲烷-异戊醇(见第A.2章),用力混合30s;12000r/min离心5min,取上层水相；加1.5倍体积—20℃预冷的无水乙醇，混匀后-20℃过夜以沉淀核酸(在不能及时进行PCR检测的情况下，可置于1.5倍体积无水乙醇中，长期保存);15000r/min离心30min,小心弃上清，立即用滤纸吸干(应尽量充分吸干),37℃干燥约20min;加10μL水溶解后，作为PCR模板。

6.2PCR扩增

PCR反应混合物总体积100μL。含10μLTaq酶用10倍缓冲液(见第A.7章)、10pL25mmol/L氯化镁(MgCl?)(见第A.6章)、2μLdNTP(各200μmol/L)、引物各2.5μL(100pmol/L)、1μLTaq酶(5IU/μL)和62μL水，然后加入10μL待测样品DNA作为模板。最后在反应混合物上覆加50μL

矿物油。

混匀后稍离心，让矿物油在上层。再将反应管置于PCR扩增仪。先94℃热变性4min,然后94℃

1min→48℃1min→72℃2min30次循环，再72℃10min,最后4℃保温。

6.3设立对照

在6.2中设立阳性对照、阴性对照、空白对照。

取已知的标