SN 1559.3-2005非洲猪瘟病毒红血球吸附试验操作规程.docxVIP

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T1559.3—2005

非洲猪瘟病毒红血球吸附试验操作规程

ProtocolofhaemadsorptiontestforAfricanswinefevervirus

2005-02-17发布

2005-07-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

I

SN/T1559.3—2005

前言

本标准参照了国际动物卫生组织(OIE)公布的《诊断试验和疫苗标准手册》(2004年版)中关于非

洲猪瘟诊断的红血球吸附试验方法。

本标准的附录A为资料性附录。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局负责起草。

本标准的主要起草人：游洪、许如苏、刘中勇、王彭军。

本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。

1

SN/T1559.3—2005

非洲猪瘟病毒红血球吸附试验操作规程

1范围

本标准规定了红血球吸附试验检测非洲猪瘟病毒的方法。

本标准适用于检测组织或外周血中的非洲猪瘟病毒。

2仪器设备

2.1组织研磨器或捣碎器。

2.2离心机。

2.3二氧化碳培养箱。

2.4恒温培养箱或水浴箱。

2.5显微镜、倒置显微镜。

2.6leigton管(160mm×16mm)。

3试验材料

3.10.9%氯化钠：配制方法参见附录A。

3.20.01mol/LpH7.4PBS(磷酸盐缓冲液):配制方法参见附录A。

3.3‘青霉素、链霉素、庆大霉素和制霉菌素。使用前宜用上述PBS分别配成10000IU/mL、

10mg/mL、500IU/mL和500IU/mL的溶液。

3.4肝素：使用前用0.9%氯化钠配成1000IU/mL。

3.5细胞基础培养液(如MEM等):配制方法参见附录A。

3.61%猪红血球：配制方法参见附录A。

3.7非洲猪瘟标准毒株。

3.8被检材料：包括肝素抗凝血和脾脏、扁桃体、肾脏、淋巴结等组织。被检材料应置于尽可能的低温，但不冻结的容器内保存、运送。

4操作方法

4.1原代白细胞血球吸附试验

4.1.1制备组织悬液

用组织研磨器或捣碎器将被检组织磨碎，加入0.01mol/LpH7.4PBS和抗菌素，配制成20%的组织悬液(每毫升组织悬液的抗菌素含量为：青霉素1000IU,链霉素1mg,庆大霉素50IU,制莓菌素50IU),备用。

4.1.2制备白细胞

采取健康猪血，用玻璃珠脱纤或用肝素抗凝(每毫升猪血含肝素100IU),700g离心30min,吸出

血清或血浆备用。另外吸取白细胞，并用细胞基础培养液洗涤3次，备用。

4.1.3配制细胞培养液

将上述血清或血浆加入细胞基础培养液内配制成细胞培养液，血清或血浆的终浓度为10%~

30%,同时加入抗菌素。

4.1.4培养白细胞

将白细胞悬浮于细胞培养液中，使细胞含量为103/mL,分装于160mm×16mm的leigton管中，

2

SN/T1559.3—2005

每管1.5mL,将试管与水平面呈5°~10°倾斜放置，置于5%二氧化碳环境中，37℃培养2d～4d;或将

白细胞分装于细胞培养板，每孔0.1mL,置于5%二氧化碳环境中，37℃培养2d～4d。

4.1.5接种

每份组织悬液接种3管或4孔白细胞培养物，每管接种0.2mL或每孔接种25μL。

用工作浓度的非洲猪瘟标准毒株接种1管或1孔白细胞培养物，作阳性对照。

另留1管或1孔白细胞培养物不接种病毒，作阴性对照。

4.1.6加红血球

37℃培养3d后，每管加入0.2mL或每孔加入25μL1%猪红血球，继续培养于37℃。

4.1.7镜检

每天用显微镜或倒置显微镜检查细胞病变和红血球吸附情况，连续检查7d～10d。

4.1.8结果判定

将培养物轻轻摇动后置于低倍镜下(10×)观察。阳性对照的白细胞表面有大量猪红血球附着，形成玫瑰花状或桑甚体状；而阴性对照的白细胞无红血球附着，则对照成立，可进行结果判定。以第10天

的检查结果为终判结果。

1管或1孔以上白细胞表面吸附有大量猪红血球的被检材料，判为阳性；否则判为阴性。

如为阴性，宜将培养物的上清液再传代或用直接免疫荧光试验检测白细胞沉淀物。

4.2外周白细胞“自动玫瑰花环”血球吸附试验

4.2.1制备抗凝血

用装有2mL0.9%氯化钠，含2000IU肝素的注射器取18ml.被检猪全血，混均后转移到试