蛋白质化学中的层析技术.pptVIP

第189页,共199页，2024年2月25日，星期天活化加热至100～110℃，除去硅胶表面因氢键所吸附的水分当温度升高至500℃时，硅酰基脱水缩合转变为硅氧烷键，不再有吸附剂的性质再生一般可用乙醇或甲醇洗涤，除去溶剂，110℃烘干活化处理第190页,共199页，2024年2月25日，星期天2、氧化铝多孔的A1203的聚合物，吸附性能也可通过改变其含水量加以控制。优点：吸附容量较高、价格低廉等缺点：具有催化性能。碱性条件下不稳定的化合物分离时容易发生诸如异构化、氧化和消除等次级反应第191页,共199页，2024年2月25日，星期天酸性氧化铝pH值约为4.0，分离酸性化合物如羧酸类碱性氧化铝pH值约为10.0，分离诸如生物碱类的碱性化合物中性氧化铝pH约为7.0，分离相对非极性的化合物如类固醇第192页,共199页，2024年2月25日，星期天活化200℃左右加温4～6小时再生弃去柱顶端的加样部位后，依次用甲醇、稀乙酸、稀氢氧化钠溶液和水洗涤，再经高温(200℃)活化第193页,共199页，2024年2月25日，星期天3、聚酰胺尼龙-6：己内酰胺聚合而成尼龙-66：己二酸与己二胺聚合而成丰富的酰胺基，可与酚类、酸类、醌类以及硝基化合物等通过氢键结合而被吸附对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差应用：生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等极性与非极性化合物的分离第194页,共199页，2024年2月25日，星期天第157页,共199页，2024年2月25日，星期天四、基本操作平衡Equilibration上样Sampleapplication洗杂Washing洗脱Elution第158页,共199页，2024年2月25日，星期天Equilibration1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionWatermoleculesHydrophobicligandGelmatrix第159页,共199页，2024年2月25日，星期天Sampleapplication1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionGelmatrixProteinsHydrophobicgroups第160页,共199页，2024年2月25日，星期天Washingoutunboundmaterial1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionConc.saltAbsNon-boundproteins第161页,共199页，2024年2月25日，星期天1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionElutionTargetelutesConc.saltAbs第162页,共199页，2024年2月25日，星期天Elution1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionConc.saltAbsMorestronglyboundproteins第163页,共199页，2024年2月25日，星期天1、层析柱的选择柱床高度通常为5～15cm对一个优化好的分离方案进行规模放大时，可保持柱高不变，增加柱的直径粗柱子（内径为1.6～5.0cm）适合进行HIC层析。第164页,共199页，2024年2月25日，星期天2、缓冲液的选择往平衡的缓冲液和样品中加入一种盐析盐，有利于固定化配基与蛋白质的相互作用。随着盐浓度的提高，结合到固定化配基上的蛋白质量也相应提高。最常用的盐：Na2SO4、NaCl和(NH4)2SO4第165页,共199页，2024年2月25日，星期天3、缓冲液的选择随着pH的升高，疏水作用相应下降由于pH升高时，被中和的带点基团增加，从而导致蛋白质的亲水性增加在中性pH条件下与疏水相互作用介质不结合的蛋白质，在酸性pH条件下则能够结合第166页,共199页，2024年2月25日，星期天4、蛋