第三章 DNA复制课件.pptVIP

3DNA复制;3.1DNA复制的基本原则

3.2DNA复制的方式

3.3DNA复制的酶类体系

3.4DNA复制过程

3.5端粒和端粒酶;3.1DNA复制的基本原则;第三章DNA复制2;1958年，Meselson及Stahl以大肠杆菌为实验材料，借助放射性同位素（15N）标记和CsCl密度梯度离心（Densitygradientcentrifugation）等技术首次证明了DNA的半保留复制模型的正确性;第三章DNA复制2;3.1.2DNA复制的半不连续性;DNA复制是以半不连续方式进行，一条链的合成按5′→3′方向连续合成，其合成方向与复制叉的移动方向一致，称为前导链（Leadingstrand），另一条链的DNA合成是在复制叉打开到一定程度后才开始的，先合成许多不连续的小片段（冈崎片段，Okazakifragment），最后合成一条完整的DNA链，称为后滞链（Laggingstrand）。;第三章DNA复制2;3.1.3DNA复制的引物;第三章DNA复制2;目的：保持DNA复制的高度忠实性。

原因：DNA聚合酶具有校正活性，而RNA聚合酶没有校正功能。在低保真引物完成功能后将其删除，而代之以DNA聚合酶Ⅰ指导合成的高保真DNA链。

结果：使DNA复制的准确性提高了105倍。;3.1.4DNA的双向复制;第三章DNA复制2;3.2DNA复制的方式;3.2.1θ型复制

原核生物DNA从起始点开始复制，随着复制叉向前推进，复制区域就像在非复制区域内产生气泡并不断扩大，形成θ结构。

Cairns揭示了大肠杆菌DNA的θ型复制过程。;第三章DNA复制2;3.2.2滚环复制

有些环状DNA以滚环模式复制，即双链中的一条链产生一个缺口，DNA聚合酶从缺口上的3′端开始，以另一条完整链为模板进行链的延伸，这样新合成的链将替代原来的亲本链，好象模板环在不断滚动。（图3-7A）;图3-7B：噬菌体ΦΧ174的单链DNA首先形成双链的复制型（Replicativeform），在DNA正链的复制起始点上进行单链切断，5′端与A蛋白相连，DNA聚合酶Ⅲ以未切断的负链为模板，从正链的3′端开始不断延伸进行复制，5′端却不断地脱离环状模板被剥离出来，成为越来越长的游离单链。当复制回到起始点时，具有内切酶活性的A蛋白切割起始点并结合于新的5′端，被替代的正链以环状形式释放。;第三章DNA复制2;3.2.3D环复制

线粒体和叶绿体的双链环状DNA从特殊位点开始解链，但两条亲代链中只有一条作为模板（H链）合成新链，开始复制出一小段DNA，取代了原来的互补链（L链），这样一条单链和一条双链组成的结构，称为置换环（Displacementloop）或D环。随着复制的继续进行，D环不断扩大，L链被不断置换，直至L链上的起始位点暴露，开始新的H链的合成。因此双链DNA的两条链分别有自己不同的Ori。;第三章DNA复制2;3.3DNA复制的酶类体系;表3-1大肠杆菌DNA聚合酶的比较;DNA聚合酶Ⅰ主要作用是在DNA复制的过程中负责清除RNA引物，该功能依赖于其5′→3′外切酶活性。

DNA聚合酶Ⅰ的“缺口平移”过程可用于制备放射性标记核酸探针。

DNA聚合酶Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段称为Klenow片段，失去了原来的5′→3′外切酶活性。;第三章DNA复制2;DNA聚合酶Ⅲ至少包含10个亚基。

α、ε、θ三个亚基构成的催化核心，α亚基具有5′→3′聚合酶活性，ε亚基具有3′→5′外切酶活性，θ亚基负责激活外切酶活性。

两个β亚基形成“夹钳”（Clamp），套在DNA模板上，在复制时沿着模板滑动，防止聚合酶从DNA上脱离。

二聚化亚基τ使两个催化核心连接在一起。

由γ2δδ′χψ组成的γ复合体作为夹钳装载机（Clamploader），负责将β亚基结合到DNA上。

因此，DNA聚合酶Ⅲ是一个不对称的二聚体，每个单体都具有一个催化核心、一个二聚化亚基、一个具有前进能力的亚基，能同时催化两条DNA链的合成;第三章DNA复制2;3.3.1.2解旋酶（Helicase）

解旋酶能利用水解ATP产生的能量使DNA解链。

在大肠杆菌中，有12种不同的解旋酶。

解旋酶通常是多聚体，典型的是六聚体结构。;第三章DNA复制2;3.3.1.3单链结合蛋白（Single-strandbindingprotein,SSB）

单链结合蛋白结合并保护DNA单链，阻止其恢复成双链体状态。

SSB一般以单体形式结合，但结合具有协同性。

大肠杆菌的SSB是一个四聚体。;3.3.1.4DNA连接酶（DNAligase）

大肠杆菌的DNA连接酶分子量为74000