第一章 克隆载体课件.pptVIP

基因克隆载体;DNA克隆载体或基因克隆载体：

将外源DNA带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子;DNA克隆载体必须具备的主要条件:;第1节质粒克隆载体;一.质粒的性质

1.质粒组成与构型

质粒:染色体外裸露的双链DNA分子

广泛存在于细菌，在真菌、蓝藻、绿

藻中也有发现

大肠杆菌质粒特性分:F型、S型、Col型

;构型:超螺旋共价闭环(ccc-DNA)、开环

(oc-DNA)、线形(l-DNA)

2.质粒的大小

2kb或100kb

相当于染色体大小的3%;4.质粒DNA的复制;第一章克隆载体;第一章克隆载体;松弛型质粒施加氯霉素可大量扩增质粒

氯霉素抑制蛋白合成，影响了基因组

DNA的合成;5.质粒的不亲合性:

亲缘关系较近的质粒一般不亲合

解释1:

inc基因合成质粒复制阻遏物

解释2:

膜结合位点饱和;第一章克隆载体;6.质粒迁移;第一章克隆载体;迁移作用(molilization):

有些非结合质粒，本身含有bom(oriT)位点,当同时存在mob基因(或存在于辅助质粒上)，借助于tra基因产物，使非结合质粒转移到受体菌中;第一章克隆载体;7.显性质粒和隐蔽质粒;二.构建克隆载体的基本策略;第一章克隆载体;三.质粒克隆载体的构建;pMB1的特点:

含有ColE1的松弛型复制起始位点

缺少好的选择标记基因

缺少较好的克隆位点;pBR322的构建

(1)保留ColE1的松弛型复制起始位点

(2)pSF124中Apr

(3)pSC101中Tcr

在抗性基因中带入合适的酶切位点

(4)缺失迁移蛋白mob基因，但保留了bom位点

;第一章克隆载体;pUC18/19

pBR322的Tcr被乳糖操纵子一段DNA取代;蓝白斑筛选(α互补)

LacZ’基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）;第一章克隆载体;第一章克隆载体;2.农杆菌Ti质粒克隆载体构建;根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分成四种类型：

章鱼碱型(octopine)、

胭脂碱型(nopaline)、

农杆碱型（agropine）、

农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine);Ti质粒可分为四个区:

(1)T-DNA区（transferred-DNAregions）：

T-DNA是农杆菌侵染植物细???时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段

DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。约25kbp。

T-DNA左右边界(LB、RB)：25bp正向重复序列

右边界（TR）序列更为保守，左边界(TL)序列在某些情况下有

所变化。其核心部分是14bp，可分为10bp(CACGATATAT)及

4bp(GTAA)两部分,是完全保守的。

内部为:ocs、nos、引发肿瘤相关基因(Onc基因);(2)Vir区（virulenceregion）

该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为

毒区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，约占Ti质粒DNA的三分之一。

(3)Con区（regionsencodingconjugations）

该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之

间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。

(4)Ori区（originofreplication）

该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。;双元载体系统（binaryvecter）：;双元载体系统的构建原理;第一章克隆载体;TA克隆载体;第2节病毒(噬菌体)克隆载体;病毒：

DNA（或RNA）和外壳蛋白

噬菌体：

感染细菌的病毒;病毒与宿主关系来分：

温和型病毒

构建载体的好材料

烈性病毒

通过改造，也可用于构建载体;一.噬菌体;第一章克隆载体;λ溶源性细菌特点：

超感染免疫性

溶原性细菌诱发进入溶菌周期

;att位点attLattR;λ噬菌体;构建λ噬菌体的基本策略与技术路线：

(1)去除λ非必须区

λ噬菌体包装:大小51-36.4kb之间