酶活性测定方法.docxVIP

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一、过氧化物酶(POD)活性的测定

POD测定参照李合生等(2003)的愈创木酚法方法进行测定,略加改动。测定:称取样品0.5g,加入5mL1/15mol/LPH=7.0的磷酸缓冲溶液,冰浴

研磨成匀浆,4℃条件下12000r/min离心15min,上清液为粗酶液。然后在试管中加pH7.0的磷酸缓冲液2ml,愈创木酚(0.2%)0.5ml,浓度为0.15%的H2O20.5ml,取0.3ml的酶提取液加入到试管中,空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度,

加入酶液时开始计时,每隔30s读数一次,连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。

△470×V

T

POD活性=

0.01×t×Vs×W

式中:△470 反应时间内吸光度值的变化;

VT 提取酶液的总体积(ml)

t 反应的时间(min)

Vs 测定时取用酶液体积(ml)

W 样品鲜重(g)

二、多酚氧化酶(PPO)活性的测定

多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法,略加改动。

酶液制备:称取样品0.5g,加入5mL0.1mol/LPH=6.0的磷酸缓冲溶液,冰浴研磨成浆,4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。

PPO活性测定:反应试管中分别加入0.1mL酶液+3.9mL磷酸缓冲液+1mL1mmol/L的邻苯二酚。混匀后于30℃保温10min,迅速加入2mL质量分数为20%的三氯乙酸终止反应,立即于525nm下测定其吸光度值,计算酶活。

PPO活性= OD×V

T

0.01×t×0.5g×Vs

= OD×VT0.005

OD——反应时间内吸光值的变化;VT 提取酶液的总体积(ml)

Vs 测定时取用酶液体积(ml)

T———反应时间(min);

三、吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性的测定

参照张志良等(1990)人的方法并稍作改动。

标准曲线的制定,配制浓度0~250μg/ml的IAA溶液,分别在530nm下测定吸光度,并绘制标准曲线。

酶液制备:称取样品0.5g,加入5mL0.1mol/LPH=6.0的磷酸缓冲溶液,冰浴研磨成浆,4℃条件下12000r/min离心20min后上清液即为粗酶液。

IAAO活性测定:量取1ml酶液+2ml1mmol/LMnCl2+1ml1mmol/L二氯酚

+2ml1mmol/LIAA+5mLPH=6.0的磷酸缓冲溶液,放入30℃的水浴中30min,对照为2ml1mol/L的MnCl2+1ml1mol/L二氯酚+2ml1mmol/LIAA+6mlPH=6.0磷酸缓冲液。将上述溶液吸取2ml,与4ml反应液(0.5mol/L的FeCl31.0ml+35%的过氯

酸30ml)混合置于黑暗处,30℃条件下保存30min,最后测定530nm下的吸光度,

并计算酶活性。IAAO活性以每mg蛋白质在1h内分解破坏1μgIAA的酶量表示酶活性大小。

吲哚乙酸氧化酶活性=

(C1-C2)×VT

W×t×V1 [μg/(g·h)]

式中:C1——对照管在标准曲线上查得IAA,μg;

C2——测定管在标准曲线上查得IAA,μg;

VT——酶液稀释后总体积,mL;V1——酶液反应时用体积,mL

W——样品重量,g;t——酶促时间,h

四、超氧物歧化酶(SOD)活性的测定

多酚氧化酶活性测定参照赵世杰等的方法,略加改动。

酶液制备:称取样品0.5g,加入5ml0.05mol/L磷酸缓冲液(PH=7.8),冰浴研磨成浆,4℃条件下10000r/min离心10min后上清液即为酶液。

SOD活性测定:反应试管中分别加入1.5mL磷酸缓冲液,0.3mL130mmol

/L的Met溶液,0.3mL750μmol/LNBT溶液,0.3mL100μmol/LEDTA-Na2溶液,0.3mL20μmol/L核黄素,0.25mL蒸馏水,0.05mL的酶液(对照加缓冲液,2支)。混匀后将1支对照管置于暗处,其他各管于4000lx日光灯下反应20min

(要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,温度低可适当延长)。反应结束后,以不照光的对照管作空白,分别测定其他各管560nm波长下的消光度值,已知SOD活性单位以抑制NBT光光化还原的50﹪为一个酶活性单位表示。

SOD总活性=[(Ack-AE)×V]/[Ack×1/2×W×a]SOD比活力=SOD总活性/蛋白质浓度

SOD总活性以每克鲜重酶单位表示;比活力单位以

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