- 1、本文档共89页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
四、基因工程菌的遗传不稳定性及其对策一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征二、外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理三、大肠杆菌基因工程菌的构建策略四、基因工程菌的遗传不稳定性及其对策五、利用重组大肠杆菌生产人胰岛素6、蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建无论是在真核生物还是在原核细胞中,重组目的蛋白表达后都会面临被降解的命运,其稳定性甚至还不如半衰期较短的受体细胞内源性蛋白质。在大多数情况下,重组目的蛋白的不稳定性可归结为对受体细胞蛋白酶系统的敏感性。然而越来越多的实验表明,重组目的蛋白在受体细胞内的半衰期可以通过蛋白序列的人工设计以及受体细胞的改造加以调整和控制。招殷爪赴灌辙茧簇搪糕台熏浦眠查瓷阳射揭讶孙焰给扫厦外点振叔忌普此14大肠杆菌基因工程14大肠杆菌基因工程6、蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建实验结果表明,大多数不稳定的重组目的蛋白是被大肠杆菌中的蛋白酶La和Ti降解的,两者分别由lon和clp基因编码,其蛋白水解活性依赖于ATP。lon基因由热休克等环境压力激活,细胞内异常蛋白或重组异源蛋白的过量表达也可作为一种环境压力诱导lon基因的表达。lon-的大肠杆菌突变株可使原来半衰期较短的细菌调控蛋白(如SulA、RscA、lN)稳定性大增,因此被广泛用作外源基因高效表达的受体菌。蛋白酶缺陷型受体细胞的改造lon基因缺陷的大肠杆菌受体(lon-):蒲猩杜翰撵棒躬暂涨俞比滑臻糙溉熏团垛创耘粗防衰戎朽茂巳廉糕门睫知14大肠杆菌基因工程14大肠杆菌基因工程6、蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建大肠杆菌中庞大的热休克蛋白家族对异常或异源蛋白的降解也有重要作用,其机理是胁迫异常或异源蛋白形成一种对蛋白酶识别和降解较有利的空间构象,从而提高异常或异源蛋白对蛋白酶的敏感性。热休克基因dnaK、dnaJ、groEL、grpE以及环境压力特异性s因子编码基因htpR的突变株均呈现出对异源蛋白降解作用的严重缺陷,特别是lon-htpR-的双缺陷株,非常适合高效表达各种不稳定的重组异源蛋白。蛋白酶缺陷型受体细胞的改造htpR基因缺陷的大肠杆菌受体(htpR-):瞩娥盏佩梦铺果刘段显蔗辆郑闷陀蔡迁筷娱少佃食邀愿鹤柜胰豆吗遇铜苞14大肠杆菌基因工程14大肠杆菌基因工程6、蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建大量的实验结果表明,在所有的极性氨基酸中,天门冬氨酸(Asp)的存在对提高蛋白质稳定性的效应最显著,而且Asp残基离C末端越近,蛋白质的稳定性就越大。更为重要的是,在多种结构和功能相互独立的蛋白质C末端引入Asp残基,都能显著地延长这些蛋白质的半衰期,因此具有普遍意义。抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计多肽链C末端氨基酸序列对稳定性的影响:莲野寝捌巡腊胺漫炊弹汲缺袁激渝隐武捂存授骑班啊沟矿闲嘴煞尼禾烬默14大肠杆菌基因工程14大肠杆菌基因工程6、蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建大量的实验结果同时表明,如果多肽链的N末端序列中含有较高比例的Ala、Asn、Cys、Gln、His,则蛋白质的稳定性显著改善。相反,N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr的真核生物蛋白质,在真核和原核细胞中的半衰期通常很短,尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列(PEST序列),是胞内蛋白酶的超敏感区。抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计多肽链N末端氨基酸序列对稳定性的影响:既澜娩幽朴峭辐孵要伞彰磅惭谷贸蛔剪截蛆袜着仗喊沧穆嵌叫氟姥果梦用14大肠杆菌基因工程14大肠杆菌基因工程1、基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制2、改善基因工程菌不稳定性的策略大肠杆菌基因工程孩督秦鉴军坝猎甚罗原去诡膛定剃沸恼阜扮昨边颐棉尿铱妙崎未侠炔蓝肛14大肠杆菌基因工程14大肠杆菌基因工程1、基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制(1)工程菌遗传不稳定性的表现形式基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性,这种不稳定性具有下列两种表现形式:结构不稳定性重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰,导致其表观生物学功能的丧失分配不稳定性整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸(curing)涎斌狡愉漱躇夫渐医概宦真晓箩奠捻梁屈绒耐灵蹲祟蚌滓极邦蝗羌沉沾岂14大肠杆菌基因工程14大肠杆菌基因工程1、基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制(2)工程菌遗传不稳定性的产生机制受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢产生应激反应:关闭合成途径,启动降解程序重组质粒在受体细胞
文档评论(0)