转基因植物的检测鉴定方法遗传转化技术及新技术.ppt

1转基因植物的检测鉴定措施选择和汇报基因/标识基因的检测转基因植物的PCR检测外源基因整合的Southern杂交鉴定外源基因转录的Northern杂交检测外源基因体现蛋白的检测生物学鉴定

21、选择基因检测重要观测转化子在添加对应抗生素或除草剂培养基上的生长抗的存活，不抗的死亡

3NPTⅡ活性检测目的：检测NPTⅡ基因在植物组织中的体现原理：NPTⅡ使ATP分子上的?-P转移到抗生素分子上，影响抗生素与核糖体的结合，从而使抗生素失活。检测时使用放射性标识的[?-32P]ATP，通过?-磷酸基团转移，生成放射性的卡那霉素来检测。检测措施：点渍法，层析法，凝胶原位检测法NPTⅡ提取物+[?-32P]ATP→32P磷酸化的卡那霉素→放射自显影

42、汇报基因检测GUS?-葡萄糖苷酸酶基因产生蓝色物质GFP绿色荧光蛋白基因产生绿色荧光LUC荧光酶素基因发射光子

5gus基因的检测gus基因编码?-葡萄糖苷酸酶基因，该酶是一种水解酶，能催化许多?-葡萄糖苷酯类物质的水解。检测常用底物有3种：5-溴-4-氯-3-吲哚-?-D-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）4-甲基伞形酮酰-?-D-葡萄糖醛酸苷酯（4-MUG）对硝基苯-?-D-葡萄糖醛酸苷（PNPG）检测措施：组织化学染色定位法X-Gluc荧光法测定GUS活性4-MUG分光光度法测定GUS活性PNPG

6组织化学染色定位法检测GUS以X-gluc为底物，在合适条件下该酶将底物水解成蓝色物质，

7gfp基因的检测绿色荧光蛋白是某些腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白。生物荧光素蛋白是指存在于生物体内，能在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。它可与目的基因构成嵌合基因，从汇报基因的体现理解目的基因体现实状况况。检测措施：对于转化细胞可用蓝光照射，在显微镜下分拣发出强烈绿色荧光的细胞。对于转化植株，可在激发光照射下运用解剖摄影系统进行绿色荧光蛋白检测和定位。

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10不具有OSPK1基因的原生体pUC-GFP具有OSPK1基因的原生体pUC-OSPK1-GFP转化对照质粒的原生质体整个细胞有绿色荧光，而转化具有OSPK1基因质粒的原生质体的绿色荧光则重要在细胞的质膜上GFP在水稻原生质体中的瞬时体现成果

113、转基因植物分子检测PCRSouthernblottingNorthernblottingRT-PCRQRT-PCRWesternblotting

12PCR检测PCR是在体外迅速特异地扩增目的基因DNA片段的有效措施。能在几小时内使pg水平的起始物到达ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后很轻易观测,不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的某些次序。但由于PCR扩增十分敏捷，有时会出现假阳性扩增，因而对外源基因与否整合需要进行扩增产物的Southern杂交。

13PCR

14Southern鉴定Southern杂交技术是1975年发明原理：运用两条单链DNA的碱基互补性，来检测外源DNA的转化成果DNA水平

15外源基因转录的Northern检测通过Southern杂交可以得知外源基因与否整合到植物染色体上。不过，整合到染色体上的外源基因并不一定体现。转基因植株中外源基因的转录水平可以通过细胞总RNA或mRNA与DNA探针的杂交来分析，称Northern杂交。它是RNA-DNA异质双链杂交。环节同Southern杂交法mRNA水平

16RT-PCR

17RT-PCR

18外源基因体现蛋白的检测外源基因编码蛋白在转基因植物中可以正常体现并体现出应有的功能是植物基因转化的最终目的。体现蛋白应具有一定的稳定性，不被细胞内的蛋白酶迅速降解，同步应对植物细胞无毒性。外源基因体现蛋白检测重要运用免疫学原理，ELISA及Western杂交是经典的措施。

19Western杂交是将外源基因转录并翻译的蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶中转移至固相支持体上，然后对固定化蛋白质进行免疫学测定，是根据蛋白质（抗原）可以和该蛋白质的特异抗体相结合的原理而进行的。蛋白质区带-----抗体（同位素标识）蛋白质水平

204、生物学鉴定及代谢测定表型鉴定稳定性鉴定最终鉴定抗病抗虫抗除草剂花色变化品质改良

21甜菜碱醛脱氢酶（AhBADH）转枳及其抗盐性研究

22AhBADH基因转枳及植株再生30days60days90days120days

23转基因植株分子鉴定

24转基因株系G