(11)--实验10 大肠杆菌的重组子遗传分析.ppt

实验10大肠杆菌的重组子遗传分析

一、实验目的

了解大肠杆菌的杂交技术及其基因在染色体上的排列方式，并掌握大肠杆菌接合及染色体基因定位的原理与方法。

;二、基本原理

大肠杆菌的杂交与致育因子F有关。有F因子的细菌称为F十，没有F因子的细菌称为F-。F-菌株之间不能进行杂交。F因子有两种状态—游离状态和整合状态(F因子插人到染色体的一定位置上，所以F因子是附加体)，前者称F+菌株，后者称为高频重组或Hfr。F+和Hfr都能与F-菌株进行杂交，但重组频率不同。在大肠杆菌的接合中，F+和Hfr是供体菌，而F-是受体菌。在F＋与F-杂交中，F因子由F+供体转移到F-受体，大部份受体变为F+。在Hfr与F-杂交中，Hfr供体的染色体由原点开始转移进人受体菌，但F因子在最后，一般不能转移进入受体，所以受体仍为F-细菌。;大肠杆菌染色体呈环状。高频重组菌株(Hfr)的染色体上整合有F因子，当Hfr细菌与F－细菌细胞发生接合(即杂交)时Hfr细胞(供体菌)的染色体从Hfr细胞向F－细胞内转移。由于染色体的转移具有一定的方向性，并且可以随时中断，因此根据结合后F－细菌(以重组子形式选出)中Hfr细菌染色体基因出现次数的多少，就可得知基因转移的先后顺序，即基因在染色体上排列的顺序。转移时，靠近转移起始点的染色体基因进入F－细胞的机率大，重组频率高；远离转移起始点的基因进入F－细胞的机会少，重组率低，F因子大部分位于转移起始点相对的一端(末端)，因此转移的频率很低。只有当接合时间很长，足以使整个染色体转入F－细胞(受体)时，才会使F－细胞转变为Hfr或F＋状态。;基因定位时首先要从Hfr与F－细菌的混合培养物中筛选出某一Hfr与F－细菌基因（选择性标记基因）已经发生了重组的细菌（重组子），然后在这些重组子中逐个测定其它的Hfr基因（非选择标记）出现的次数。Hfr菌株染色体上的选择性标记应位于染色体前端，这样才能保证以100％的频率出现在重组子中。选择性标记之后的基因，则以低于100％的频率出现在重组子中。F－细胞的选择性标记应起到排除Hfr菌生长的作用（即反选择）。本实验使用的F－菌株为Strr,Hfr菌为Strs,借此可排除Hfr菌的生长。另???方面为保证Hfr基因有机会出现在重组子中，反选择性标记应位于染色体后端。为了使Hfr菌株有较高的接合频率，F－细菌应该过量以保证每一个Hfr细菌都能与F－细菌接合（10～20：1）。;大肠杆菌的重组频率较低，即使是高频重组，其重组频率也在10-3-10-4。为了在一个较大的杂交群体中发现为数较少的重组子，就要应用选择性培养基。亲本细胞在选择性培养基上不能生长，只有重组子能生长，因此在选择性培养基上长的菌落即为重组子。

然后再分析一定数量的重组子中各非选择性标志的分离。在我们的实验中，选用各种糖发酵基因及氨基酸作为非选择性标志，根据各非选择性标记的重组百分数，确定这些糖发酵基因及氨基酸利用在染色体上的位置。;本试验的适宜条件是在新鲜的肉汤培养液中，以4×108/毫升的F一细菌和2×107/毫升的Hfr混合，其比例是一个Hfr菌对20个F-菌，37℃通气接触100分钟。然后稀释取样，以使每皿得到适量的重组子作为原始培养皿，再用影印培养法分析非选择性标志的分离。;三、实验材料

1.受体菌：402F－leupurEtrphismetAilvargthiaralacYxylmtlgalTT6rstrrrifr。

2.供体菌：401Hfrsupstrs。;四、器皿及试剂

1．用具：

培养皿（9厘米），灭菌三角瓶（50毫升），灭菌吸管（1,5,10毫升），灭菌离心管，灭菌空试管，圆木柱，丝绒。

2.培养基：

1)生理盐水：0.85%NaCl。

2)10×A缓中液。

K2HPO410.5g×10

KH2PO44.5g×10

(NH4)2SO41.0g×10

柠檬酸钠1.0g×10

pH7.01000mL;3)200.0g/L糖溶液：葡萄糖、乳糖、半乳糖每种各取20g，分别溶于100ml蒸馏水中，高压蒸气灭菌5.516×105Pa，15分钟。

4)0.25M硫酸镁：250mL溶液中含MgSO4.7H2O15.4g

5)盐酸硫胺素(VB1)：10mL中含盐酸硫胺素10mg，高压蒸气灭菌5.516×104Pa，15分钟。

6)链霉素溶液：100万单位的链霉素1瓶，加蒸馏水至20mL，不需灭菌