生化技术原理：第一章 生命大分子物质的制备.ppt

3.超声波法它是借助声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。加石英砂则可缩短时间。为防止产生过多的热量，用间歇处理和降低温度的方法。4．压榨法此法是一种温和、彻底破碎细胞的方法。用1.77×108-3.54×108Pa的压力迫使几十毫升细胞悬液通过一个小孔（＜细胞直径的孔），致使其被挤破、压碎。5．冻融法将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀、破碎。二、溶胀和自溶1.溶胀细胞膜为天然的半透膜，低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象称溶胀。例如，红血球置清水中会迅速溶胀破裂并释放出血红素。2.自溶细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，发生溶解的现象称自溶。特别小心操作，水解酶不仅可使细胞壁、细胞膜破坏，也可把有效成分在自溶时分解。三、化学处理用脂溶性的溶剂（如丙酮、氯仿、甲苯）或表面活性剂（SDS）处理细胞时，可把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类等物质，并导致整个细胞破碎。四、生物酶降解生物酶（如溶菌酶）有降解细菌细胞壁的功能。用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。例如，从某些细菌细胞提取质粒DNA时，不少方法都采用加溶菌酶（来自蛋清）破细胞壁的步骤。第四节抽提指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。1.可用缓冲液，或稀酸、稀碱、有机溶剂（如丙酮、乙醇）等溶液抽提2.还可用蒸馏水抽提一般理想的抽提溶液应具备的条件1）对有效成分溶解度大，破坏作用小；2）对杂质不溶解或溶解度很小；3）来源广泛、价格低廉、操作安全等。二、抽提有效成分的影响因子1.pH值2.金属离子3.溶剂的浓度4.极性1．pH值对具有等电点的两性电解质物质，抽提液的pH值应在偏离等电点的稳定范围内。碱性蛋白质选用低pH值的溶液抽提；酸性蛋白质选用高pH值的溶液抽提；用调至一定pH值的有机溶剂抽提。注意调pH值时，注意搅拌，避免局部出现过高的酸、碱浓度，导致所需物质变性有些抽提过程的最适pH值与使有效成分的活性稳定的pH值并不一致2.溶剂的极性和离子强度有些蛋白质或酶在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。增加蔗糖或甘油的浓度二甲基亚砜或二甲基甲酰胺使溶液的极性大大降低降低极性的方法提高溶液的离子强度在水溶液中加入中性盐如KCl、NaCl、NH4Cl和(NH4)2SO4一般而言：离子强度较低的中性盐溶液促进蛋白质溶解，保护蛋白质活性的作用。离子强度过高则引起蛋白质发生盐析作用。常用的盐溶液是NaCl溶液，浓度以0.15mo1/L为宜。为促使蛋白质与核酸、蛋白质与细胞器的分离，则宜用高浓度（0.5-2.0mo1/L）的盐溶液。粘多糖类物质也溶于高离子强度的盐溶液。若用有机溶剂抽提蛋白质等物质时，加入少量的中性盐也可使其稳定。用高浓度盐溶液的抽提物上层析柱时，一定要将盐除去。3.水解酶—自身存在这些酶在合适的条件下，与欲抽提的蛋白质或核酸发生反应，导致蛋白质或核酸分解，而使实验失败。使这些酶丧失活性：加入抑制剂（苯甲基磺酰氟化物，简称PMSF）调节抽提液的pH、离子浓度或极性等4．温度蛋白质或酶在低温（如0℃左右）最稳定。如，在生产人绒毛膜促性腺激素（HCG）制品时，一定要在低温下进行。从鸟肝分离出的丙酮酸羧化酶正好相反。它对低温敏感，25℃时才稳定。5．搅拌能促使欲抽提物与抽提液的接触，并能增加溶解度采用温和的搅拌方法，速度太快时容易产生泡沫，致某些酶类变性失活6．氧化蛋白质都含有必须的巯基，若抽提液中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间的二硫键，导致酶（或蛋白质）失活（或变性）。1)β-巯基乙醇（1-5mmol/L）2）半胱氨酸（5-20mmo1/L）3）还原谷胱甘肽4）巯基乙酸盐（1-5mmo1/L）等还原剂可以防止巯基发生氧化作用，或者延缓某些酶活性的丧失。

在抽提液中加入植物组织或微生物——酚类化合物当细胞破裂时，它可在多酚氧化酶的作用下转变为醌类物质，使抽提液的颜色由无色变为棕褐色，严重影响了有效成分的提取。加10％苯基硫脲或3×10-3mol/L聚乙烯吡珞烷酮或者是前面提到的还原剂，即可防止这一现象的发生。7．金属离