遗传工程动物.ppt

优点：转基因范围广，转移基因大，可达数百kb；且转基因不含任何病毒基因组片段，绝对安全。缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不表达；整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位缺失等；需显微操作仪，技术性要求强。显微注射法(二)逆转录病毒介导法慢病毒性载体体积较小，不适合携带太大的(10kb)的DNA片段。使用病毒性载体时，要注意安全。为了确保病毒性载体的安全性，以下技术已经用于构建病毒性载体：首先，消除其复制能力，使其不能自我增殖。因此只能反转录一次。其次，改变其包装性状，使其只能在特定细胞系中包装而获得感染能力。此外，引入基因突变，使其转录功能失活。虽然通过酶切修饰和重组等技术可以去除或者减少病毒性载体的治病性，但是，不同来源的病毒性载体，其结构和安全性可能有所不同，要选择适当的慢病毒性载体，必要时要进行进一步修饰重组并反复验证，确保安全。在包装时，每次只能包装一种载体，以免发生DNA重组，从而产生致病性。第三，在专用工作台上操作，并且要采取适当的防护措施。逆转录病毒结构LTR:Longterminaterepeat1、逆转录病毒法制备转基因动物目的基因插入区域逆转录病毒法基本步骤构建病毒载体转染包装细胞收集病毒颗粒感染受精卵胚胎移植表达gag,pol,env细胞逆转录病毒法制备转基因动物的优缺点优点转基因效率高单位点、单拷贝整合，易分析插入位点鸡卵等含卵黄多的受精卵适宜缺点随机整合携带外源DNA片段大小受限，一般小于10kb易产生嵌合体（mosaic)，实验周期长有安全隐患，有可能因DNA重组产生活病毒。（三）.胚胎干细胞法将ES细胞植入动物囊胚后,可参与宿主胚胎的形成,直至达到种系嵌合,因此,可将其作为一种载体,把外源DNA导入ES细胞就可以实现由此发育而成的转基因动物。该方法的优点是外源基因的整合率很高,约50%,整合率在生殖细胞中的比例约为30%。缺点是不易建立ES细胞系。利用胚胎干细胞法制备转基因小鼠的过程1.分离培养ES细胞。2.ES细胞基因操作。3.获取囊胚期胚胎，以作为ES细胞的移植受体。4.通过显微操作将ES细胞注射到囊胚期胚胎的囊胚腔内，形成嵌合体。5.将注射过ES细胞的胚胎，移植到交配后3d的假孕母鼠子宫内，培育出转基因小鼠。优点：基因转移效率大大提高，且能进行定位基因转移。缺点：需要多代才能得到纯合的转基因动物，这对饲养成本高，产仔数较少的大型哺乳类动物来说，要获得转基因动物是一件需要大量资金投入的事情。(四）精子载体法

意大利Lavitrano等1989年首次报道利用精子作为载体获得了转基因小鼠。精子载体法是精子和外源DNA混合培养时，外源DNA可直接进入精子的头部，通过受精将外源基因引入动物细胞中。外源DNA导入精细胞的方法有DNA与精子共育法、电穿孔导入法、脂质体转染法。（五）细胞核移植法先在体外培养的体细胞中进行基因导入并筛选。然后将带转基因体细胞移植到去掉细胞核的卵细胞中，生产重构胚胎.（六）生殖细胞转染法四、外源DNA整合、转录及表达的分子检测1）外源基因的整合检测PCRDot-blotSouthern-blot2）外源基因的转录检测northern-blot原位杂交3）外源基因的表达检测血液生化ELASA病理、免疫组织化学基因产物的检测western-blot4.基因动物品系或品种的建立第一代转基因动物是半合子转基因动物，因为外源基因仅在一条染色体上稳定整合。只有通过选种选配，将两个半合子转基因动物成功交配，才能得到纯合子转基因动物，建立转基因动物家系，外源DNA才能在后代中稳定遗传纯系转基因动物的培育Founder小鼠╳正常小鼠F1阳性小鼠（AO）F1阳性小鼠（AV）╳正常小鼠近亲繁殖以得到纯合小鼠F2阳性小鼠（AO）F