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筛选核酸中的单核苷酸变异的方法

专利名称：：筛选核酸中的单核苷酸变异的方法筛选核酸中

的单核苷酸变异的方法相关专利申请的交叉引用本申请要

求以2007年5月14日提交的美国临时申请No.60/917，763

作为优先权基础。美国临时申请No.60/917，763的全部内

容以援引的方式纳入本文。

背景技术：

：已经许多药物的效力与基因中的特异突变或多态性联系起

来。个性化基因药品的时代已经实现。现在医生正在根据基

因信息来开药方。传染病医生基于在从患者身上分离的人类

免疫缺陷病毒中发现抗性突变来开治疗AIDS的药物(RheeSY，

etal.AntimicrobAgentsChemother2004;48(8):3122-6)。细

胞色素p450基因的多态性正被用于确定患者的药物代谢物

状态

(Ingelman-SundbergM.TrendsPharmacolSci2004;25(4):19

3-200)。表皮生长因子受体基因中的突变在10%的非小细胞

肺癌患者中激活对药物吉非替尼(gefitinib)的严重临床反

应(LynchTJ，etal.NEnglJMed2004;350(21):2129-39)。此

外，癌症的早期检测和治疗显著地减少痛苦和死亡。实际上，

大多数癌症在及早发现时都是可医治的。对基因组DNA进行

分子分析以检测体液中的少量癌症细胞是一种有前途的早

期检测癌症的方法。肿瘤细胞会短暂地流入到邻近的体液中。

局部肿瘤的恶性细胞已在血液、痰液、尿液和粪便中被检测

到。由于这些体液中存在大大过量的正常细胞，因此灵敏地

检出这些稀少的细胞是非常困难的。从这些细胞的正常或野

生型DNA产生的分子信号压倒或远超过所述微小的突变部分

的信号。随着人类基因组序列得以阐明，与基因突变相关的

疾病数目持续增加。已出现许多技术来正向选择这些微小突

变从而可以对其信号进行扩增以超过野生型信号。这些技术

可分为两种检测已知突变的技术和检测未知突变的技术。对

DNA中已知位点处的突变的灵敏检测可用现有技术容易地完

成。可设计等位基因特异引物来靶向已知位置的突变，从而

使其信号可被优先于野生型DNA扩增。遗憾的是，这对于可

发生在目标序列的任何位置(碱基)上的未知突变是不可能的。

大多数癌症基因突变都不位于限定位置。Kras基因在癌症中

是高度突变的。突变集中发生于热点区的外显子12和13，

但也可发生在整个基因中。核酸测序是检测核苷酸变异的最

终标准。核酸测序也适于检测可发生在目标核酸节段内任何

碱基处的未知突变或多态性。最常用的方法酶法DNA测序的

化学自从其概念产生开始本质上一直相同(Sangeretal.，

Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，74，5463(1977))。然而，其

在费用、读出长度和突变检测方面具有限制。该领域已经通

过可实现其自动化的技术(如荧光染料、机器人技术和自动

检测的电泳系统的引入)而得以提高。然而，如果基因变异

在样本群中以低频率发生，自动化所需的花费对大多数实验

室来说都太高。即使在手工模式下，测序也是非常昂贵的因

为其是劳动密集的。这限制了它作为检测工具的广泛应用，

尤其是当所述变异在待测样本群中以低频率发生时。此外，

读出长度受到电泳分离分辨能力的限制。用DNA测序检测突

变不总是明显的，尤其是突变与野生型序列相比少于20%时。

DNA微阵列，也称为基因芯片和寡核苷酸微阵列，在检测已

知和未知变异中都逐渐获得更多的主流应用

(HaciaJG.NatGenet1999;21(lSu卯l):42-7)。它们特别适

于对通常来自少数个体的特定基因序列的高密度分析。然而，

由于高昂的设备和生产花费，其不适于对未知变异的大批量

筛选。芯片在检测插入和缺失突变上也是非常低效的。还成

问题的是，通过加入寡核苷酸来检测这些突变会使芯片的复

杂度增到2-4倍。此外，如同测序一样，微阵列没有足够的

灵敏度来检测可能以微小比例存在于大量野生型DNA中的突

变。因此，对与药物效力有关的基因变异的发现和检测受到

现有技术的不足所阻碍。因此本领域中需要简单经济的方法

来在测序前筛选核苷酸中的未知变异核酸。

发明内容本文公开的方法涉及检测核酸中核苷酸变异的领

域。应理解并且本文涵盖，本文公开的方法