NYT 2288-2012 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫检测与鉴定方法.docx

ICS65.020

B16

中华人民共和国农业行业标准

NY/T2288—2012

黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫检测与鉴定方法

DetectionandidentificationofCucumbergreenmottlemosaicvirus

2012-12-24发布2013-03-01实施

中华人民共和国农业部发布

I

NY/T2288—2012

前言

本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。本标准由农业部种植业管理司提出。

本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)归口。

本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、辽宁省植物保护站、沈阳农业大学。本标准主要起草人：王福祥、蔡明、吴元华、熊红利、李潇楠、江冬、李明福、李眷、张昆

NY/T2288—2012

黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫检测与鉴定方法

1范围

本标准规定了农业植物检疫中黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫检测及鉴定方法。本标准适用于黄瓜绿斑驳花叶病毒的检疼检物定

2规范性引用文件

下列文件对于本文件件。凡是不注日期的引

GB15569农运

3原理

黄瓜绿斑马

穗、砧木和种子其病原形态、果(RT-PCR

4试剂与材

碳酸钠(二氢钾(KH?(NaOH)、乙市售酶标抗体

病青(病

学特性、

核病毒

0

方碳酸

、氯行

所有试剂纯

5仪器及用具

度仕等。台式离心机、分水平电泳槽、培养箱、

度仕

等。

6取样方法

必不可少配B日期的引注日期的版本适用于本文

其最Q版本(自托在的修改单态用于

检

病毒属，随嫁接最终腐烂变味。PCR反应结

内a

水亚

比降

)、无水磷酸 )、氢氧化钠水、市售抗体、

象A

、水浴锅、电泳仪及

6.1种子样品

取样数量与方法按GB15569的规

6.2植株或果实样品

随机选取发病叶片或果实，以幼嫩叶片和果实为主。每份样品数量不少于200g,装入自封袋中密封低温保存，并注明采集时间、地点、采集人等信息。

7检疫鉴定

7.1症状检验

在瓜类作物生长期，选择有代表性的地块，检查叶片、果梗、果实，与黄瓜绿斑驳花叶病毒的典型症状进行比较，参见附录B。

7.2快速诊断检验

2

NY/T2288—2012

快速诊断试纸条或诊断试剂盒检测法参见附录C。如采用市售的试剂盒，按说明操作。

7.3酶联免疫吸附测定法

黄瓜绿斑驳花叶病毒酶联免疫吸附测定法参见附录D。如采用市售的试剂盒，按说明操作。

7.4RT-PCR检测法

黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-PCR检测法参见附录E。如采用市售的试剂盒，按说明操作。

8结果判定和报告

8.1结果判定

8.1.1典型症状判定

西瓜果实发病且符合典型症状的可直接判定，必要时做其他检测。

8.1.2快速诊断试纸条或诊断试剂盒结果判定

按产品使用说明进行判定。

8.1.3酶联免疫吸附测定法结果判定

在阴性对照OD值≤0.1,且阳性对照OD值大于阴性对照OD值2倍的前提下，样品孔OD值大于阴性对照OD值2倍时，判定为阳性反应，即样品带黄瓜绿斑驳花叶病毒，否则判定为阴性反应，即样品不带黄瓜绿斑驳花叶病毒。

8.1.4RT-PCR检测法结果判定

观察电泳结果，在阳性对照在500bp处有条带出现，且阴性对照无条带出现的前提下，待测样品在500bp处有条带出现，判断样品携带黄瓜绿斑驳花叶病毒、否则判定为阴性反应，即样品不带黄瓜绿斑驳花叶病毒。

8.2结果报告

将实验室检验鉴定结果填入《植物有害生物样本鉴定报告》(见附录F)。

9除害处理

检验过程中使用的有关材料料和用具，在使用完毕后须进行消毒和除害处理。经检疫鉴定后的种子样品应保存在4℃冰箱内，叶片和果实样品应保存在-20℃以下或冻干保存三个月备查，保存期满后，进行灭活处理。

3

NY/T2288—2012

附录A

(资料性附录)试剂配制方法

A.1包被缓冲液

Na?CO?1.59g,NaHCO?2.93g,NaN?0.2g,蒸馏水定容至1000mL,调整pH至9.6,4℃贮存。

A.2洗涤缓冲液

Na?HPO?1.15g或Na?HPO?·12H?O2.9g,KH?PO0.2g,NaCl8.0g,KCl0.2g,吐温一200.5g蒸馏水定容至1000mL,调整pH至7.