SN∕T 4781-2017 出口食品和饲料中产志贺毒素大肠埃希氏菌检测方法 实时荧光PCR法.docx

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T4781—2017

出口食品和饲料中产志贺毒素大肠埃希氏菌检测方法实时荧光PCR法

DetectionofShigatoxin-producingEscherichiacoliinfoodandanimalfeedforexports—Real-timePCRmethod

2017-05-12发布2017-12-01实施

中、华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

I

SN/T4781—2017

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：邵景东、申进玲、封振、王传现、薛峰、郭旸、吴福平、王毅谦、李晓红、祝长青、肖震、崔思宇。

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SN/T4781—2017

出口食品和饲料中产志贺毒素大肠埃希氏菌检测方法实时荧光PCR法

1范围

本标准规定了出口食品和饲料中产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光PCR快速检测方法。

本标准适用于出口食品和饲料中产志贺毒素大肠埃希氏菌(O157、0104、0111、026、0145和

O103)的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27403实验室质量控制规范食品分于生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

产志贺毒素大肠埃希氏菌Shigatoxin-producingEscherichiacoli;STEC

含有志贺毒素编码基因str的大肠埃希氏菌。

3.2

肠出血性大肠埃希氏菌Shigatoxin-producingEscherichiacolicausingtheattachingand

effacinglesion

同时含有志贺毒素编码基因stx和紧密素编码基因eae的大肠埃希氏菌。

注：这种毒力基因组合常与STEC所引起的严重疾病相关。3.3

实时荧光PCRrealtimePCR

在PCR反应体系中加入荧光集团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。3.4

Ct值cyclethreshold

每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。

4方法提要

对样品中微生物进行增菌培养后提取核酸，采用实时荧光PCR方法对志贺毒素编码基因stx和紧密素编码基因eae进行检测。若样品中stx阳性，继续进行菌株分离；若stx和eae阳性，继续进行O血

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SN/T4781—2017

清组编码基因rfbE(0157)、wzx(O104)、wbdl(O111)、wzx(O26)、ihpl(O145)和wzx(O103)的检测。若检测到以上某种O血清组阳性，可先对特异的O血清组菌株富集再进行菌株分离。

5培养基和试剂

除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

5.1改良胰蛋白胨大豆肉汤(mTSB):见附录A中A.1。

5.2缓冲蛋白胨水(BPW):见A.2。

5.3CHROMagarSTEC显色培养基：见A.3。

5.4CHROMagarO157显色培养基：见A.4。

5.5改良山梨醇麦康凯(CT-SMAC)琼脂：见A.5。

5.6三糖铁琼脂(TSI):见A.6。

5.7TE溶液。5.810%SDS。

5.9蛋白酶K(20mg/mL)。

5.10氯化钠(NaCl):5mol/L和0.7mol/L。

5.1110%CTAB。

5.12三氯甲烷。

5.13异戊醇。

5.14异丙醇。5.1570%乙醇。

5.16核酸提取试剂盒。

5.17PCR预混液。

5.18引物和探针：见附录B。

5.19诊断分型血清：0157、0104、0111、026、0145和O103混合多价或单因子血清。

5.20AP