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原代内皮细胞的分离与培养
材料
1.PBS
3.DMEM/F12.
5.青霉素G(5000U/mL)+链霉素(5000μg/mL).
6.内皮细胞生长添加剂（ECGS）.
7.肝素.
8.热处理FBS。56°C，30min(seeNote1).
9.HUVEC培养基(Table1).使用前加温到室温或37°C。建议分装到50-mL管，4°C储存，
直至使用。避免重复加温和冷却。
10.胶原酶A(Sigma).13mg/100mL溶解到无血清的DMEM/F-12，含青霉素和链霉素分别
50U/mL和50μg/mL。0.2-μmfilter过滤。应该现用现配。
11.胰蛋白酶EDTA.A5X储备液（Table2）.0.2-μmfilter过滤消毒。以10-mL分装入50-mL
管，-20°C储存。使用前加40mL无菌去离子水稀释到1X。4°C保存可达到4周。
12.纱布(高压灭菌).
13.套管。
14.双向开关活塞。
15.止血钳。
16.尼龙绳。
17.手术刀片。
18.烧杯。
19.酒精。
20.O.2-μm滤膜。
21.漂白粉。
22.30-mL注射器。
23.0.2%明胶。，2%明胶储备液1mL稀释到9mLPBS制成0.2%明胶工作液10mL。
24.50-mL管。
25.100-mm组织培养板(Falcon).
26.Ficoll-Paque(Amersham).
29.HUVEC冷培养基。需要容量的45%FBS、45%HUVEC培养基和10%二甲基亚砜(DMSO)
混合，需要时现配。使用前必须是冰冷的。
30.抗体：兔抗人vWF)(Dako),羊抗人VE-cadherin(SantaCruz).
31.4%多聚甲醛(Fisher)。在通风橱内，加热到65°e，每100mLPBS溶解4g多聚甲醛。逐滴加
入1MNaOH直至溶液变清。用0.5MHCI调整pH7.0，S4°C储存。
32.Dil-conjugated乙酰化的LDL(AcLDL)(MolecularProbes).(光敏感)。用无血清的MCDB稀
释成10μg/mL。
33.DAPI(4,6-diamidino-2-phenyindole)(Sigma)(光敏感).水溶解成2mg/mL的储备液。储备
液分装，-20°e储存。每10mLPBS溶解5μL储备液制成lμg/mL的工作液。工作液避光储存于
4°C，最长2周。
Table1PreparationofHUVECMedium
DMEM/F-12Tofinalvolumeof500ml
Table2PreparationofTrypsinEDTA(5X)
Methods
HUVEC的分离。
下面的方法7-10d在100mm的培养皿融合成单细胞层。(seeNote2).
1新鲜的脐静脉(lessthan24hold)置于无菌容器，储存于4°C直至使用。(seeNote3).
2开始之前打开生物安全罩至少15min，喷洒70%酒精风干。
3准备胶原酶溶液，预温至37°C。长13-20CM的脐带需要约25mL胶原酶溶液。
4在生物安全罩内从容器取出脐带。70%酒精轻微浸泡纱布，包裹脐带的一端。轻轻捏住
纱布擦拭脐带到另一端，清除表面血液和清除腔内的凝血块。(seeNote4).
5将导管插入脐静脉的一端；
6用尼龙线在适当位置固定导管。
7连接双向开关到导管。
8关闭双向阀。拔出注射器的活塞并把注射器连接到双向开关。25mLPBS充满注射器。
插入活塞，打开双向阀并放脐带的开口端在大废物烧杯上。慢慢用PBS冲洗脐带。冲掉红
细胞和小血凝块，直至洗出的液体变得清亮。(seeNote5).
9关闭双向阀，分离注射器，拔出活塞，重新连接注射器到双向开关。不要在连接到注射
器时拔出活塞，这样产生的真空就会把组织和血液吸入导管。用预温的胶原酶溶液充满注射
器。(seeNote6)在插入活塞，打开双向阀。用胶原
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