蜜蜂微孢子虫病绿色防治技术规程.docxVIP

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蜜蜂微孢子虫病绿色防治技术规程

1范围

本文件规定了蜜蜂微孢子虫病诊断与鉴定、防控的方法。

本文件适用于蜜蜂微孢子虫病症状、形态及分子生物学诊断和综合防治。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T19168蜜蜂病虫害综合防治规范

SN/T1683蜜蜂微孢子虫病诊断方法

OIE陆生动物卫生法典

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1蜜蜂微孢子虫

是一种侵染成年蜜蜂中肠上皮细胞引起蜜蜂发病的致病性真菌，包括蜜蜂微孢子虫和东方蜜蜂微孢子虫2个种。

3.2消毒

指为杀灭包括蜜蜂疫病病原体或寄生虫而采取的一种措施，适用于可能被直接或间接污染的场所、工具及各种物体

[来源：OIE陆生动物卫生法典，有修改]

3.3监测

指系统而持续地收集、整理和分析与蜜蜂微孢子虫病有关的信息，并及时向相关人士传递信息以便采取相应的措施。

[来源：OIE陆生动物卫生法典，有修改]

4诊断与鉴定

4.1诊断流程

当观察到蜂群出现典型症状时应遵循先通过个体症状观察初步确诊，再取样后通过显微镜鉴定即可确诊。如需对没有明显症状的蜂群进行早期诊断或例行养蜂场的病害监控则可采用PCR鉴定方法。

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4.2症状

4.2.1蜂群症状

4.2.1.1急性重症感染

1)蜂群粪便：蜂箱外壁或周围地面会出现大量棕色约0.5cm长的细长条状粪便，或出现粪便变稀、颜色变深现象。

2)蜂群表现：在蜂巢入口处及养蜂场地面，会见到患病爬行的和死去的蜜蜂。且蜂群群势急速下降。

4.2.1.2轻度感染

除了部分成年蜜蜂在蜂箱外爬行外，没有其他异常表现。

4.2.2蜜蜂个体症状

蜜蜂个体感染病原后可通过如下症状进行初步判断。

a)病蜂活动状况，患病蜜蜂表现出行动迟滞，腹部膨大，飞翔无力等症状。

b)用镊子从具有典型症状的蜜蜂腹部末端夹出中肠及后肠仔细观察，健康蜜蜂中肠呈棕色，环纹明显，并且具有弹性和光泽。如观察到蜜蜂中肠膨大，呈乳白色，环纹不清，失去弹性和光泽，可初步确定为蜜蜂微孢子虫病。

4.3实验室鉴定

4.3.1显微镜鉴定

4.3.1.1样品处理

将采集的蜜蜂样本，分离腹部置于研钵中，加入5-10mL蒸馏水研磨。取研磨的组织涂片，在明场或相差光学显微镜下以400-600倍进行检查。

4.3.1.2鉴定

4.3.1.2.1初诊

如在视野中见到长约5-7μm，宽约3-4μm，椭圆形的孢子，边界折光明显，则可初步确诊。4.3.1.2.2鉴别

按SN/T1683相关方法与酵母、真菌孢子、脂肪体或马氏管变形虫囊包进行鉴别。

4.3.2PCR鉴定

4.3.2.1DNA提取

提取缓冲液配方见表1。

表1DNA提取缓冲液配方

试剂名称

浓度

CTAB

0.03M

Tris

0.05M

EDTA

0.01M

NaCl

1.1M

注：缓冲液最终用ddH2O将pH值调至8.0

操作步骤如下：

1）取蜜蜂的中肠（取样部位见图1），置于一个预冷的（加入液氮）1.5mL离心管中并匀浆。2）离心管中加入300μL提取缓冲液以及4μL20mg/mL的蛋白酶K溶液，置于60℃水浴3h。

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3）加入等体积（300μL）的苯酚:氯仿为1:1的混合液并轻轻混匀，13000rpm离心15min。

4）将上清液移至另一个新管中，沉淀物重复用苯酚:氯仿为1:1的混合液混匀并离心1次，合并2次的上清液。

5）加入预冷的600μL95%的乙醇后加入30μL3M的NaOAc，轻轻混匀，置于-20℃下过夜。

6）10000rpm离心15min，移去上清液，沉淀用1mL70%的乙醇洗涤两次。

7）烘干10min后加入30μLddH2O，置于65℃水浴10min，轻轻溶解混匀管中的沉淀物。

8）10000rpm离心10s以除去未溶解的物质，即得蜜蜂中肠组织的DNA。

9）提取的DNA溶液置于-20℃保存，备用。

图1蜜蜂中肠取样部位

A：中肠；B：小肠；C：后肠；D：蛰针

4.3.2.2PCR扩增

将前步所提取的DNA样品稀释5倍进行PCR反应，反应体系及引物参见附录A。将15μLPCR反应体系准确吸取至PCR板孔中，设定反应程序为：

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