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基于纤维素降解混合菌系宏基因组的几丁质酶基因克隆

摘要：本试验首先对实验室可直接降解滤纸的纤维素酶产生菌混合菌系CM3宏基因组测序序列进行分析，筛选出GH家族相关基因，根据功能注释信息，进一步筛选GH家族相关基因。使用NucleotideBLAST工具，筛选出新基因的全长序列，用primer软件设计新基因的引物。提取混合菌系DNA，以混合菌DNA为模板，利用PCR技术进行基因克隆扩增出降解纤维素等大分子聚合物的系列相关基因，测序确定基因序列。结果表明，PCR扩增获得了全长1164bp的Y1_k141_44737_2基因，为构建原核表达载体提供材料。生物信息学分析表明，该基因编码蛋白质氨基酸序列长度为387aa，分子量为42592.15Da，理论等电点（pI）为6.71，是一个不含跨膜区域的亲水性蛋白。

关键词：宏基因组学；降解纤维素；几丁质酶基因；基因克隆

引言

纤维素是由D－葡萄糖苷以β－１，４－葡萄糖苷键连接组成的高分子化合物，是地球上最丰富的有机化合物。利用廉价的木质纤维素类可再生资源生产液体燃料和多种生物化工产品,能大幅减少秸秆焚烧、餐厨垃圾等造成的环境污染，因此对木质纤维素有效合理的开发利用成为研究的重点[1]。毛婷、魏亚琴等从耗牛粪便中分离到了可以产生纤维素降解酶的短小芽孢杆菌，优化后的纤维素酶液处理小麦、玉米和水稻秸秆，30℃时羧甲基纤维素酶与滤纸酶活达到最高；温度超过35℃时，随着温度的升高羧甲基纤维素酶与滤纸酶活明显减低，与初始pH为6.5、接种量5%、培养时间30h，羧甲基纤维素酶活最高为520U/mL相比，滤纸酶活为98U/mL[2]。陈芳芳等从短小芽孢杆菌中克隆α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43并在E.coliBL21DE3原核表达系统中重组表达，以燕麦木聚糖为底物，Xyn43的最适pH为6.0，最适反应温度为50℃，与商业木聚糖酶有协同作用，协同水解效率高于木聚糖酶单独作用，产生更多的木糖、木寡糖与阿拉伯糖[3]。

从自然界样品中直接分离环境中的DNA，构建环境DNA文库并直接克隆功能基因的方法，称为”宏基因组学”。在自然界中大部分微生物未能获得纯培养，严重阻碍人们对其的了解及应用[4]。Lee从山羊瘤胃宏基因组文库中筛选到一个GH5家族内切葡聚糖酶，与其他同源GH5蛋白的序列相似性为41%[5]；Jensen从堆肥文库中获得一个耐热的纤维素降解酶，可以降解工业纤维素底物挪威云杉和葡甘露聚糖[6]；Gupta对温泉宏基因组文库进行筛选，获得内切葡聚糖酶，其最适pH值为8，在碱性条件下依然保持较高的催化活性[7]。

本实验基于功能宏基因组学的方法，从实验室保藏的纤维素酶产生菌混合菌系CM3的宏基因组测序数据中挖掘纤维素降解相关基因，设计引物，PCR克隆目的基因，为后续构建原核表达载体提供材料。

材料与方法

实验材料1.1.1菌种来源

本实验室保藏的可直接降解滤纸的纤维素酶产生菌混合菌系CM3。

试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒，AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒，琼脂糖，Trans2KDNAMaker，λ/HindIIIDNAMaker，EasyTaqMIX,由公司合成的上下游引物，6Xloadingbuffer，胰蛋白胨，蛋白胨，Tris，EDTA，冰乙酸，酵母粉，氯化钠，碳酸钙。

培养基

PCS培养基：蛋白胨5g，酵母粉1g，氯化钠5g，滤纸（气爆纤维素）3g，碳酸钙2g，蒸馏水1000mL,滤纸剪成小块放入，pH调至8，121℃灭菌20min。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。

主要仪器

琼脂糖凝胶电泳仪，凝胶成像仪，PCR仪，紫外切胶仪，冷冻离心机，旋涡混合仪，摇床，高压蒸汽灭菌锅，实验室专用超纯水机，超净工作台，电子天平，移液枪。

实验方法

降解纤维素混合菌宏基因组测序序列分析

混合菌宏基因组测序后经过拼接处理获得unigene序列，分别与Nr数据库，KEGG数据库及CAZy数据库等进行比对分析，筛选出GH家族相关基因，根据功能注释信息，进一步筛选降解纤维素等大分子聚合物的系列相关基因。使用

NucleotideBLAST工具，筛选出新的GH家族全长序列。用primer5软件设计这些基因的PCR上下游引物。表1PCR引物序列

引物名称

引物序列（5→3）

44737_2－F

5GCGGCCGCATGCTGCCGGCGGGACTG3

44737_2－R

5TTAGTAGGTCCACCAATTCCCGGGGTACC3

CM3混合菌的活化培养

从实验室已有的可降解纤维素混合菌CM3的保藏菌种中