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VPO1在ox-LDL诱导的内皮功能不全及炎症反应中的作用及机制

研究

冠心病(coronaryarterydiseases,CAD)是一种常见的严重危害人们身心

健康的疾病,动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是其病理生理基础,研究表明

内皮功能不全及炎症反应是动脉粥样硬化形成的核心环节,但其机制尚未完全阐

明。血管过氧化物酶(Vascularperoxidase,VPO)是本课题组发现并命名的一种

新的过氧化物酶,其为过氧化物酶家族成员之一,与髓过氧化物酶

(myeloperoxidase,MPO)具有高达44.5%的同源性,二者均可催化过氧化氢

(H202)(弱氧化剂)成为次氯酸(HOC1)(强氧化剂)从而发挥其生物学功能,与MPO

主要由中性粒细胞和单核巨噬细胞分泌不同,VPO主要存在于血管及心肌组织中,

目前已证实VPO具有两种亚型,VPO1和VP02,在血管内皮中的以VPO1表达为主。

我们之前的研究证实冠心病患者血浆中VPO1浓度显著升高,且与氧化性低

密度脂蛋白(ox-LDL)呈明显正相关。此外,VPO1基因沉默后可显著抑制ox-LDL

诱导的内皮细胞凋亡,其机制与抑制NADPHgp91phox蛋白表达,从而抑制

ROS/p38MAPK/caspase-3通路有关,提示VPO1可能与AS发生发展密切相关。

但目前VPO1在AS形成中的作用及机制尚不完全清楚。因此,本研究拟探讨

VPO1在ox-LDL诱导的内皮功能不全及炎症反应中的作用及其机制。

本研究将有助于阐明VPO1的生物学功能,为研发新的抗动脉粥样硬化药物

提供理论依据。第一部分VPO1在ox-LDL诱导的内皮功能不全中的作用及机制目

的：从分子细胞水平,运用转染VPO1shRNA等分子生物学技术,探讨VPO1在

ox-LDL诱导的内皮功能不全中的作用及其机制。

方法：实验分为两个部分：(1)研究ox-LDL诱导内皮细胞VPO1的表达。分

组如下：量效实验：分为4组：对照组和不同浓度的ox-LDL组(用含50μng/ml、

100μg/ml及200μg/mlox-LDL的培养液孵育内皮细胞24h)。

时效实验：分为8组：不同时间的对照组(不加任何干预因素,用培养基培养

内皮细胞0、12、24、48h)和ox-LDL组(用含100μg/mlox-LDL的培养液孵育

内皮细胞0、12、24、48h),提取细胞总蛋白,采用western-blot方法检测细胞

内VPO1的表达,采用荧光法检测细胞内HOC1水平。(2)研究VPO1基因沉默对

ox-LDL诱导的内皮细胞NO/eNOS/DDAH/ADMA系统及细胞内HOCl生成的影响。

分组如下：分为6组：空白对照组：用含1%小牛血清的DMEM培养液孵育内

皮细胞24小时；VPO1shRNA组：在成功构建稳定沉默VPO1的细胞模型中,用含

1%小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时；Non-TshRNA组：在内皮细

胞中转染Non-TshRNA(非特异性shRNA)后,用含1%小牛血清的DMEM培养液孵

育内皮细胞24小时；ox-LDL组：用含109μg/mlox-LDL的培养液孵育内皮细

胞24小时；+VPO1shRNA组：在成功构建稳定沉默VPO1的细胞模型中,用含100

μg/mlox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时；+Non-TshRNA组：在内皮细胞

中转染Non-TshRNA(非特异性shRNA)后,用含100μg/mlox-LDL的培养液孵育

内皮细胞24小时；提取细胞上清液检测NO(氧化还原法)及ADMA含量(HPLC法),

提取细胞总蛋白采用western-blot方法检测细胞内eNOS/DDAH的表达,采用荧光

法检测细胞内HOCl水平。结果：(1)ox-LDL显著促进内皮细胞VPO1蛋白表达

及HOCl水平。

(2)与对照组相比,ox-LDL(100μg/ml)培养内皮细胞24h显著抑制内皮细胞

NO生成、eNOS及DDAH表达,而VPO1基因沉默可逆转ox-LDL对内皮细胞的上述

抑制作用,转染非特异性shRNA对ox