《生物技术制药》第2章基因工程制药-2.pptx

基因工程制药基因工程制药GeneEngineeringforPharmaceutics（二）

基因工程制药1、基因工程技术：基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。知识回顾

基因工程制药2、基因工程技术生产药品的优点：a.可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质b.可以提供足够数量的生理活性物质，c.可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；d.通过基因工程和蛋白质工程进行改造；e.基因工程技术可获得新型化合物，知识回顾

基因工程制药知识回顾制备基因工程药物的一般程序GetTargetGeneConstructionRecombinantPlasmidConstructionGeneEngineeringBacteriumCultureEngineeringBacteriumSeparateandPurifytheProductsFiltrationBacteriaFreeIdentificationSemi-manufacturedGoodsIdentificationFinishedProductsMakeuporPackaging

基因工程制药目的基因的获得构建DNA重组体构建工程菌外源基因表达产物的分离纯化目的基因的表达产品的检验与包装知识回顾4、基因工程药物制造的主要步骤

基因工程制药5、目的基因的获取途径：一、逆转录法二、反转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）三、化学合成法四、表型克隆筛选基因五、改造基因知识回顾

基因工程制药学习内容1、基因表达

基因工程制药第四节基因表达基因表达？是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。

基因工程制药基因表达研究的主要问题:目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键。

基因工程制药1、宿主细胞的基本要求：①容易获得较高浓度的细胞；②能利用易得廉价原料；③不致病、不产生内毒素；④发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态⑤容易进行代谢调控；⑥容易进行DNA技术操作；⑦产物的产量、产率高，且易提取纯化。一、宿主细胞的选择

基因工程制药2、宿主细胞的分类：①原核细胞，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；②真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞。

基因工程制药2.1原核细胞（1）大肠杆菌（E.coli）：c

基因工程制药特点:A、大肠杆菌中的表达不存在信号肽，故产品多为胞内产物，提取时需破碎细胞，此时细胞质内其他蛋白也释放出来，因而造成提取困难。B、由于分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体(inclusionbody)，表达产物必须在下游处理过程中经过变性和复性（refold）处理才能恢复其生物活性。

基因工程制药C、在大肠杆菌中表达不存在翻译后修饰作用，故对蛋白质产物不能糖基化，因此，只适于表达不经糖基化等翻译后修饰仍具有生物功能的真核蛋白质，在应用上受到一定的限制。D、由于翻译常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。大肠杆菌会产生很难除去的内毒素，还会产生蛋白酶而破坏目的蛋白质。

基因工程制药（2）枯草芽孢杆菌：分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体。该菌也不能使蛋白质糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解，因此，它的应用也受到限制。

基因工程制药（3）链霉菌：重要的工业微生物。特点是不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌。

基因工程制药2.2真核细胞（1）酵母（Yeast）：繁殖迅速，可廉价的大规模培养，而且没有毒性，基因工程操作与原核生物相似，表达产物直接分泌到细胞外，简化了分离纯化工艺。表达产物能糖基化。特别是某些在细菌系统中表达不良的真核基因，在酵母中表达良好。目前以酿酒酵母应用最多。干扰素和乙肝表面抗原已获成功。

基因工程制药（2）丝状真菌：很强的分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲霉）被确认是安全菌珠，有成熟的发酵和后处理