《微生物遗传实验》课件.pptVIP

**********************微生物遗传实验通过对微生物的遗传实验,我们可以深入了解微生物的遗传特征,并应用于实际生产和科研中。本课件将介绍微生物遗传实验的基本内容和研究方法。实验目的探索基因表达调控通过大肠杆菌转化实验,观察外源基因在大肠杆菌中的表达情况,了解基因表达受到的各种调控因素。掌握基因克隆技术学习常用的基因克隆实验操作流程,如质粒构建、大肠杆菌转化、抗生素筛选等,培养学生的实验技能。检测重组蛋白活性测定重组蛋白的酶活性,验证基因克隆的成功,为后续进一步应用研究奠定基础。实验原理基因组操作通过在大肠杆菌中引入目标基因,对其进行遗传修饰和表达,是此实验的核心原理。细胞转化利用化学方法或电穿孔技术,将外源DNA导入大肠杆菌细胞,使其能表达目标基因。抗生素筛选通过植入含有抗生素抗性基因的质粒,使转化成功的细胞能在抗生素存在下生长。实验步骤准备实验材料收集所有需要的培养基、菌株、抗生素等实验材料,并确保它们处于良好的状态。制备培养基按照标准程序配制所需的培养基,确保pH值和灭菌状态符合要求。转化大肠杆菌将重组质粒转入感受态细胞中,利用热休克或电穿孔的方式引入细胞内。筛选重组菌株在含有适当抗生素的培养基上培养转化后的细菌,选择具有抗性的重组菌株。提取重组质粒采用碱裂解法或试剂盒等方法从选择的重组菌株中提取重组质粒DNA。鉴定重组质粒通过测序、限制性酶切等方法对提取的重组质粒进行鉴定和确认。实验材料菌株与质粒大肠杆菌菌株DH5α、BL21(DE3)。含有目的基因的重组质粒pET28a。培养基与试剂LB培养基、抗生素（卡那霉素、氨苄青霉素等）、DNA连接酶、限制性内切酶、PCR试剂盒等分子生物学试剂。实验器材细菌培养箱、PCR仪、电泳仪、离心机、微量加样器等常见的分子生物学实验设备。耗材EP管、移液枪头、离心管、含有目标基因的质粒DNA、琼脂糖电泳凝胶等。大肠杆菌培养基制备1培养基配制首先需要根据实验需求选择适合的培养基成分,如LB培养基、M9最小培养基等,并按照标准配方称量和混合。2灭菌处理将配制好的培养基倒入培养皿或试管,并使用高压蒸汽灭菌锅进行高温灭菌处理,以确保培养基无菌。3冷却保存待培养基冷却至合适温度后,即可存放于4℃冰箱中保存,以备后续实验使用。大肠杆菌菌株选择大肠杆菌K12株这是实验中常用的菌株,对实验条件较为温和,适于初学者操作。大肠杆菌DH5α株该株具有高转化效率,适合进行基因重组及质粒构建等实验。大肠杆菌BL21(DE3)株这是一种优良的蛋白表达菌株,能够高效表达重组蛋白。大肠杆菌JM109株该菌株遗传背景清晰,适用于基因克隆和测序等实验。大肠杆菌转化1受体细胞准备挑选优质大肠杆菌菌株2质粒DNA准备提取目标基因的重组质粒3热休克处理使细胞膜暂时通透吸收DNA4筛选转化子在选择性培养基上鉴定阳性克隆大肠杆菌转化是微生物遗传实验的关键步骤之一。首先需要选择合适的大肠杆菌菌株作为受体细胞,然后提取目标基因的重组质粒DNA。通过热休克处理,使细胞膜暂时变得更加通透,从而有利于外源DNA的吸收。最后在选择性培养基上筛选出转化成功的阳性克隆。这一过程非常重要,关系到后续实验的成败。抗生素筛选抗生素选择根据实验目的选择合适的抗生素。常见的包括青霉素、卡那霉素和氯霉素等。每种抗生素有不同的抗菌谱和筛选目的。浓度优化需要测试不同浓度的抗生素对大肠杆菌的杀伤效果,以找到最佳浓度。一般从低浓度开始递增试验。抗性筛选将含有重组质粒的大肠杆菌菌株接种在含有抗生素的培养基上,筛选出可以存活的转化细胞。阳性对照设置不含抗生素的对照组,确保转化过程的正确性。重组质粒提取1收集细胞从培养基中收集表达重组蛋白的大肠杆菌细胞2裂解细胞采用碱裂解法溶解细胞壁和细胞膜3分离质粒DNA利用离心分离质粒DNA和染色体DNA4纯化质粒使用柱层析法进一步提纯质粒DNA重组质粒的提取是微生物遗传实验的关键步骤。首先需要收集表达目的基因的大肠杆菌细胞,然后采用碱裂解法溶解细胞壁和细胞膜,释放出质粒DNA。通过离心分离,可以将质粒DNA与染色体DNA分离开来。最后使用柱层析法进一步提纯质粒DNA,以备后续实验使用。重组质粒鉴定1限制性内切酶消化使用特异性限制性内切酶切割重组质粒,以确认目标基因的插入位置和大小。2凝胶电泳分析通过凝胶电泳可以清楚地观察到重组质粒的条带图谱,验证是否成功构建。3DNA序列测定对重组质粒进行DNA测序,准确地确认目标基因的序列信息和插入位置。重组蛋白表达选