基于N蛋白的ELISA检测鸭血清中C型禽偏肺病毒抗体的方法研究.pdf

摘要

禽偏肺病毒（AvianMetapneumovirus,AMPV），早期称为禽肺病毒（Avian

pneumovirus,APV），也被称作火鸡鼻气管炎病毒（Turkeyrhinotracheitisvirus,TRTV）。

该病毒会导致鸭出现产蛋率下降与蛋质量差、孵化率下降和呼吸道症状，对鸭养殖业

造成严重损失。为防控疾病，常通过使用药物或免疫疫苗对该病进行防治，在发病后

养户会对病鸭使用抗生素等药物，这些药物残留在鸭体内会导致食品安全问题。因此，

开发相关的快速检测诊断技术，为AMPV的诊断以及疫苗免疫后抗体水平监测提供

有效且便捷的技术手段，可以从源头上解决食品中药物残留导致的食品安全问题。

目前，血清学诊断技术广泛应用于血清中抗体的检测中，不仅可以在疾病早期对

疾病进行诊断又可以辅助指导疫苗免疫程序的制定。其中酶联免疫吸附（Enzyme-

LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）凭借着敏感性高、特异性强、操作简单、耗时短、

无需大型仪器等优点在临床诊断中受到重视。但是目前国内外并无报道检测鸭血清中

AMPV抗体的ELISA方法，检测对象都为鸡或火鸡。为填补该方面的空缺，本研究

利用禽偏肺病毒N蛋白首次建立间接法ELISA和双抗原夹心法ELISA用于检测鸭血

清中C型禽类偏肺病毒抗体，主要研究内容及结果如下：

（1）在经过对比国内外流行的禽偏肺病毒与其8个结构蛋白后，选择了保守性

好的N蛋白作为特异性抗原蛋白。并对已发表在基因文库的N蛋白基因序列进行同

源性对比和构建进化树进行分析。最终确定国内的流行株S01株的N蛋白作为目的

抗原蛋白。在对该基因序列进行大肠杆菌表达密码子优化后，选择带有氨苄青霉素抗

性和6×His标签的pET-32a做为载体质粒。经过表达和纯化的条件优选后，获得了浓

度为2.75mg/mL的重组AMPV/C-N蛋白，该重组蛋白为可溶性表达，分子量约为

57kDa。

（2）基于表达纯化的重组AMPV/C-N蛋白建立了AMPV抗体间接法ELISA方

法。在对各反应条件进行优化后，确定的包被条件为包被浓度0.6875μg/mL，使用

0.05MCBS稀释，于4℃包被12h；封闭条件为5%BSA于37℃封闭30min；阳性

临界值为0.237、阴性临界值为0.183。与5种常见鸭病阳性血清无交叉反应，批内批

间CV（变异系数）值为0.74%~9.35%，检测328份临床血清样品的总符合率为92.38%。

说明建立的间接法ELISA有着良好的特异性、敏感性、重复性和准确性，为禽偏肺病

毒的临床诊断和疫苗免疫程序制定提供了一种便捷的技术手段。

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（3）在建立并初步应用间接法ELISA方法后，又进一步基于重组AMPV/C-N蛋

白和HRP（辣根过氧化物酶）标记的HRP-AMPV/C-N蛋白建立了双抗原夹心法ELISA

方法。在对各反应条件进行优化后，确定的包被条件为包被浓度0.6875μg/mL，使用

0.05MCBS稀释，于4℃包被6h；封闭条件为15%蔗糖于37℃封闭150min；使用

0.5%0.01MPBST按1:2000稀释HRP-AMPV/C-N蛋白；阳性临界值为0.286、阳性

临界值为0.230。与5种常见鸭病阳性血清无交叉反应，批间批内CV值为1.91%~8.63%，

检测328份临床血清样品的总符合率为97.26%，在临床样品的检测中发现建立的双

抗原夹心法ELISA表现出了比间接法ELISA更好的准确性和样品区分度。

综上所述，本研究建立了2种便捷高效、特异性与灵敏性好的鸭血清中AMPV抗

体检测ELISA方法，填补了鸭AMPV抗体检测ELISA方法的空缺，为AMPV的疾

病诊断、流行病学调查和辅助指导疫苗免疫流程提供了便捷的技术手段。

关键词：禽偏肺病毒；重组AMPV/C-N蛋白；间接法ELISA；双抗原夹心法ELISA

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