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摘要
miRNA是一类大小约为22个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子,且多数miRNA
在各种癌细胞中表达失调。miRNA广泛参与转录后的基因表达调控,通常与下游靶基
因结合,调节细胞周期、凋亡、迁移,以及侵袭等过程,从而调控肿瘤的发生与发展。
结缔组织生长因子(CTGF)是一种富含半胱氨酸的细胞外基质蛋白,相对分子量为38KD,
在人体内参与调控多种细胞功能以及复杂的生理活动。此前,本实验室通过基因芯片检
测发现CTGF与肝细胞增殖存在密切联系,因此推测其对肝癌细胞增殖存在调控作用。
利用TargetScan、miRBase、miRDB等生物信息学软件预测发现,miR-124-3p与CTGF
之间可能存在靶向关系。现有研究表明,miR-124-3p在乳腺癌、膀胱癌、胃癌、胶质母
细胞瘤以及白血病等疾病中存在表达失调并且发挥不同的功能,但关于miR-124-3p在
肝癌中的调控机制却鲜有报道。为了证实miR-124-3p靶向CTGF调控肝癌细胞的作用
机制,本文以HepG2和Hep3B细胞为实验材料,在体外水平研究了miR-124-3p与CTGF
的靶向关系、二者在肝癌细胞中如何发挥作用等问题。
为了探究相关miRNA在肝癌细胞中的表达情况,本文首先用qRT-PCR法检测了
miR-124-3p在人正常肝细胞HL-7702以及人肝癌细胞HepG2和Hep3B中的相对表达量,
发现miR-124-3p在两种肝癌细胞中的表达水平低于正常肝细胞,可由此推测miR-124-3p
在肝癌细胞调控中发挥潜在作用。然后对细胞转染模拟物(mimic)改变肝癌细胞中
miR-124-3p的表达量,在HepG2和Hep3B细胞中建立过表达体系。利用MTT法、CCK-8
法、EdU细胞增殖检测、Transwell小室法等实验技术来检测细胞活力、细胞增殖,以及
细胞迁移和侵袭能力的变化,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期变化。结果表明,
miR-124-3p表达上调后显著降低了两种肝癌细胞的细胞活力,抑制了细胞增殖、细胞迁
移以及侵袭能力;并且使G1期细胞占比提高,S期和G2/M期细胞占比降低,抑制细
胞周期进程,加速细胞凋亡。利用qRT-PCR和WesternBlot检测CTGF所涉及的一些信
号通路中相关分子表达的改变,以及EMT相关指标的变化。miR-124-3p过表达后对相
关通路蛋白的检测结果也与上述结果一致,且EMT相关蛋白表达变化显示miR-124-3p
过表达抑制了肝癌细胞的EMT过程。
接下来本文验证了CTGF基因在两种肝癌细胞中的表达显著高于正常肝癌细胞,并
I
继续通过qRT-PCR和WesternBlot检测miR-124-3p过表达体系中CTGF表达水平的变
化,结果显示过表达的miR-124-3p显著抑制了CTGF的表达水平。本文通过构建CTGF
重组过表达质粒,将mimic和过表达质粒同时共转染进入HepG2和Hep3B细胞,目的
是抵消miR-124-3p过表达引发的CTGF表达下调和相关指标的改变。对共转染后的
HepG2和Hep3B细胞采用Westernblot和qRT-PCR评估转染的效果,结果表明共转染
组中CTGF表达量重新上调。然后我们利用相关实验及方法,检测相关指标的恢复情况。
结果都证明了miR-124-3p通过靶向CTGF对肝癌细胞HepG2和Hep3B的调控作用。
综合以上结果,本研究证明了miR-124-3p通过靶向CTGF在肝癌细胞中发挥促凋
亡、抑制增殖和EMT进程的作用,这些结果可能为探究肝癌细胞的调控机制以及肝癌
的临床治疗提供一个新的思路。
关键词:miR-124-3p,CTGF,肝癌,细胞凋亡,EMT
II
ABSTRACT
miRNAsareaclassofendogenousnon-codingsingle-strandedRNAmoleculesofapproximately
22nucleotidesinsize,andmostmiRNAsaredysregulatedinexp
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