酵母杂交技术原理及应用.ppt

酵母双杂交系统的建立主要有二类载体:a含DNA-bindingdomain的载体；b含DNA-activatingdomain的载体。这二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localizationsequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有：GAL4(1-147)；LexA(Ecoli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有：GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。123456酵母双杂交系统的建立酵母双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reportergene)的重组质粒的宿主细胞。〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株具有许多优点:〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。酵母双杂交系统的建立视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。将这两个质粒共转化于酵母细胞中。将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。杂交系统通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为:酵母双杂交系统的建立1添加标题采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。2添加标题信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。3添加标题杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。4添加标题通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：酵母双杂交系统的优点和特点酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点:作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。例如已报道成功分析了RAP1与RIF1ii、P21cip1与CDK2iii、p16与CDK4iv等之间的相互作用。酵母双杂交系统的应用联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用01当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能02利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响

杂交的报告基因能否表达