酶活性测定方法讲解.pptx

酶活性测定方法

掌握：酶活性的测定方法。教学目标熟悉：方法学评价。

3量微、一般不能测定其浓度酶（催化）活性浓度指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。酶活性测定优点：灵敏、容易、测定范围广酶活性浓度测定技术

41.按检测方法分类根据产物或底物的理化性质不同（颜色、浊度、pH、气体、荧光、放射性）量气法、分光光度法、荧光法其他方法（放射性核素法、离子选择电极法，旋光法、极谱法、HPLC或生物发光法等）2.按反应时间分类（1）定时法（Fixedtimeassay，取样法、终点法、两点法）（2）连续监测法（速率法或动力学法）一、酶活性浓度测定方法

按检测方法分类——底物或产物浓度的检测测定项目方法原理测定手段胆碱酯酶氯化乙酰胆碱做底物产生乙酸根电位滴定法脂肪酶三油酸甘油酯悬乳液做底物，生成油酸甘油一酯，浊度下降浊度法淀粉酶淀粉做底物，一定时间后，剩余的淀粉不足以使碘呈兰色时间滴定法丙氨酸氨基转移酶赖氏法比色法丙氨酸氨基转移酶IFCC推荐法分光光度法丙氨酸氨基转移酶固定化谷氨酸氧化酶膜生成过氧化氢，利用过氧化氢电极生物传感器N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶4-甲基伞形酮N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷做底物荧光葡萄糖6磷酸脱氢酶NADPH在365nm激发下产生荧光荧光

61．量气法：——操作烦琐，灵敏度低，技术要求高。利用有些酶在反应过程中消耗氧气或产生二氧化碳来测定。

72．比色法与分光光度法吸光度ABC???????

300400500600700波长A、B、C三种物质的吸收波长

8Eg：某一酶催化下列反应：AEB+C可以看出C在590nm处有一吸收峰，而A、B在此处无吸光度变化，故可测定C的吸光度而无须停止酶促反应，而且C测定的灵敏度比A、B好。此法的最好例子是Warburg利用NAD（P）H在340nm处有一吸收峰，而NAD（P）毫无吸光性——建立了动态法。

91）比色法：（581，721等）在酶促反应作用一段时间后，加入显色剂，用比色计在可见光处比色。如：淀粉酶测定

102）分光光度法（自动生化分析）优点：①不局限在可见光，可扩展至紫外、红外；②能找出在不需停止酶促反应条件下，直接测定产物或底物；③分光光度计使用近似单色光的光源，在此条件下吸光度为一常数，用△A/△T即可计算出反应速度，而不需作标准管或标准曲线缺点：需要带恒温装置、灵敏度低

113、荧光法和同位素法：利用一些物质具有发出荧光的特性，如甲基伞形酮可发出强烈荧光；用340nm紫外光激发NAD（P）H也可产生兰色荧光。目前在此基础上发展起来时间分辨荧光法。荧光法：灵敏度高，但操作不易掌握，对试剂、仪器要求高。同位素法：对人体有害，操作麻烦，目前已很少使用。其他方法：①离子选择性电极法；②旋光法；（利用物质在酶促反应过程中产生光学异构体，来测定其旋光度的变化）③极谱法；④高效液相色谱法。

12定时法（固定时间法）测定酶与底物作用反应一定时间后底物或产物变化的总量，计算酶促反应平均速度。优点：比较简单，无需恒温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。缺点：无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于线性期。利用该法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要非常精确，否则会引起较大误差。

13连续监测法指在酶促反应过程中用仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间的变化量，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。优点无须终止酶促反应，不需添加其它成色试剂，观察到整个反应过程，选择线性反应期来计算酶活性，结果准确可靠。要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能。

14连续监测法的种类直接法是指待测酶酶促反应的底物或产物有特征性的理化性质，然后通过特殊的仪器直接检测。基于NADH或NADPH的反应原理：LD、α-HBD等基于人工合成色素原底物：ALP、GGT、AMS等基于氧的消耗：各种氧化酶

15（1）目前以分光光度法最为广泛，利用340nm处吸光度的变化测定各种脱氢酶。NAD(P)++H+NAD(P)H仅在260