羊水细胞等贴壁细胞培养及其染色体制作.pptVIP

细胞培养无菌操作基本技术工作环境的处理使用层流超净工作台是最经济有效的手段。超净工作台正常工作时，向下的气流可阻挡外界空气污染物进入超净台。实验前，无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30-60分钟灭菌，用70%酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10分钟后，才可开始实验操作。每次操作只处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染。实验结束后，将实验物品带出工作台。如需要继续进行下一个实验，则用70%酒精擦拭无菌操作台面，再让无菌操作台风机运转10分钟后，才可进行下一个实验操作。无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞，必要物品，如试管架、移液器或吸管头等可以暂时放置，其它实验用品用完后应及时移出，以利气体流通。实验用品要用70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台内。实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。小心取出无菌实验用品，避免造成污染。切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口，不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，用手夾住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。工作人员应注意自身的安全，必须穿戴实验衣与手套后才进行实验。对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心，并选择适当等级的无菌操作台（至少两级）。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心有毒性试剂，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐物品伤人等。定期检查下列项目：CO2钢瓶内的CO2压力；CO2培养箱内的CO2浓度、温度、及水盘是否有污染；无菌操作台内气流压力是否正常，定期更换紫外灯管及HEPA过滤器滤膜，预滤网﹙300小时/预滤网，3000小时/HEPA）。人羊水细胞培养及染色体制备人的羊水细胞能长成单层并可连续进行传代培养，但它们的一些特征与一般成纤维细胞不同。在羊水中存在着各种不同类型的胎儿细胞，依据其外形和生长特征可区分为以下三类：上皮细胞（E）、成纤维细胞（F）和羊水细胞（AF）。E细胞在胰酶消化的连续培养中不再生长，所以在培养过程中的生长期最短。01AF细胞在再培养中一开始就长得很好，染色体分析大多用这类细胞。02F细胞在再培养中潜在的生长期最长，在较老的羊水培养物中占优势。03通常在培养后3—4天（可能更早些）即出现E细胞的集落，它们不适合再培养作染色体分析。大约在第7天出现的AF细胞可被用于染色体制备。如果在培养后第10天还未见长出新的细胞，就应考虑第二次羊膜穿刺。实验用品、实验试剂见实验操作手册01040203细胞接种与培养在无菌条件下抽得妊娠18-22周羊水后，注入10ml离心管中，共抽4管约32ml，立即送检进室后，以1500rpm离心10min进无菌室，在无菌操作台上吸去上清液，每管约留0.5ml，吸管打散细胞。制成细胞悬液，再加入约4.5ml完全培养基入管内，吸管轻混匀，移至25cm2方形培养瓶中置含5%CO2的37℃温箱行开放式培养内容与方法一般5天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时，视情况（有较好的梭形细胞克隆）可换上换液用培养基，继续培养24-48小时，如细胞生长状况好，即可加入秋水仙素0.04ug-0.08ug/ml,(20ug/ml，7号针头垂直加2滴)4-6小时左右行细胞学处理倒出瓶中细胞液入10ml离心管，0.85%NaCl冲洗细胞壁两遍收集细胞悬液：离心，1500rpm，10min，去上清细胞收获25%EDTA-trypsin消化3-5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用吸管吹打细胞。低渗：加入0.075MKCl4ml-6ml，吸管吹打，37℃水浴3min-5min(或0．4%柠檬酸钠1∶1作为低渗液,每管8ml，低渗10min)。预固定：加入1.5ml左右，轻混匀37℃水浴5min，离心,1500rpm,10min。固定：加入3:1固定剂8ml左右，轻混匀，37℃水浴10min03离心，1500rpm，10min，去上清02重复固定：同上01室温1500rpm离心10min，去上清，约留0.5ml04调悬液：视管底细胞量加入几滴新鲜固定剂，并吹打混匀滴片：每片1-2滴,滴片4-6张烤片：75℃烤箱烘烤3小时第二天行显带处理：同外周血注意事项羊水标本应及时送检，送检过程中不宜受热或冰冻，实验人员收到羊水后应先观察羊水是否清亮，含胎脂的多少及是否为血性羊水；羊水中少量红细胞不需处理,如有明显血性羊水,立即在羊水中加入无菌肝素一滴。羊水细胞等贴壁细胞培养及其染色体制作技术与原理此外，为了制取细胞产品而设计了转鼓培养法，使用大容量的圆培养瓶，在培养过程中不断地转动，使培养的细胞始终处于悬浮状态之中而