蛋白酶活性的测定方法及原理.pptVIP

蛋白酶活性的测定方法及原理罗老师组员宁舒婷陈丽君陈海梅王熙栋各种测定方法及原理考马斯亮蓝法甲醛滴定法DHT-酪蛋白法DNA-溴乙锭荧光分析法X-光胶片法福林酚法甲醛滴定法1考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合，主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色，在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。2考马斯亮蓝法3蛋白酶催化蛋白质水解成氨基酸，再用甲醛固定氨基酸的氨基，用0.1mol/LNaOH溶液滴定生成的氨基酸，从而测定其酶活。01考马斯亮蓝法02甲醛滴定法03用5-氨基四唑重氮盐将氨基酸中部分组氨酸和酪氨酸重氮化，得到黄色的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。以DHT-酪蛋白为底物，在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽，二价离子可与DHT-蛋白与DHT-肽形成稳定的可溶性红色螯合物，而锌离子可迅速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。选用合适浓度的锌离子和镍离子作为沉淀剂和显色剂，利用比色法可测定蛋白酶酶活。考马斯亮蓝法DHT-酪蛋白法溴乙锭插入双链DNA的碱基对之间时，可使DNA的荧光增加25倍。接近饱和的溴乙锭(0.5μg/mL)与DNA混合时，其荧光增加量与DNA的浓度呈正比。在DNA-组蛋白-溴乙锭溶液中加入蛋白酶时，蛋白酶水解结合在DNA链上的组蛋白，使DNA结合部位暴露出来，溴乙锭重新插入DNA双链中，荧光增加量与蛋白酶活性呈正比。通过测定DNA溶液的荧光增量来计算蛋白酶的活性。考马斯亮蓝法DNA-溴乙锭荧光分析法X-光胶片法酶的底物明胶涂抹在X-光胶片上，当待测酶液滴加到X-光胶片上时，酶将X-光胶片上的明胶水解，用水冲洗胶片，即可看到胶片上明胶被酶水解的地方，出现透明的圆圈。酶活性的高低与透明圆圈的面积成正比。测定圆圈的面积以测定蛋白酶的活性。。考马斯亮蓝法福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色钼蓝和钨蓝混合物，而蛋白质分子中有含酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应，利用此原理测定蛋白酶酶活。考马斯亮蓝法福林酚法重点本次实验就是采用福林酚法测定蛋白酶活性福林酚法测定蛋白酶活性蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。原理分析天平：精度0.0001g恒温水浴：精度±0.2℃计时表分光光度计沸水浴器振荡混合器pH计:精度0.01pH单位乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶磷酸缓冲液（pH=7.5）适用于中性蛋白酶硼酸缓冲液(pH=10.5)适用于碱性蛋白酶0.4mol/L碳酸钠溶液0.4mol/L的三氯醋酸液0.5mol/L的NaOH10.00mg/ml酪素溶液100μg/ml酪氨酸标准溶液试剂仪器标准曲线的绘制试管0试管1试管2试管3试管4试管5100μg/ml酪氨溶液（ml）O12345蒸馏水（ml）1098765酪氨酸实际浓度（μg/ml）O1020304050L-酪氨酸标准溶液按下表配制分别取上述溶液各1.00ml(须做平行试验)，各加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml。福林试剂使用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值，其K值应在95~100范围内。