蛋白质组学与分析技术课第九讲.pptVIP

酵母双杂交体系的实验程序诱饵蛋白自激活作用检测待筛cDNA文库片段克隆在AD质粒载体上把cDNA文库质粒转化到含诱饵载体BD-X的感受态酵母菌内检测挑选阳性克隆酵母质粒DNA提取并转化大肠杆菌提取细菌质粒酶切鉴定明确与已知靶蛋白X相作用的Y蛋白的核苷酸序列待筛cDNA文库质粒的准备将已知靶蛋白质X的编码基因插入BD质粒载体，构建诱饵载体1单杂交系统（One-hybridsystem）2三杂交系统（Three-bindinghybidsystem）4无核双杂交系统（Non-nucleartwo-hybridsystem）3反向双杂交系统（Reversetwo-hybridsystem）酵母双杂交衍生系统单杂交系统单杂交系统是1993年发展出来的一种研究蛋白质和DNA相互作用的实验体系，用于确定识别特异DNA结合蛋白。在该系统中，转录激活域AD相融合的待筛选蛋白质Y直接与DNA结合位点相结合，使AD直接激活启动子下游报告基因的表达。这一过程无需BD-X的参与，因而通过对AD-Y文库的筛选可分离出与靶DNA序列直接作用的蛋白质Y。0102酵母单半杂交系统(one-and-a-halfhybridsystem)也是一种筛选DNA结合蛋白的方法，它结合了单杂交系统和双杂交系统的特点。是专门用来鉴别那些只有在与第二个已知配体以异二聚体形式复合时才结合DNA的蛋白质，或者用来鉴别那些不能自主结合DNA、但在有附属蛋白质存在时可以形成稳定的三维复合物的蛋白质。另外，还出现了一些由双杂交系统衍生而来的既能筛选蛋白－蛋白相互作用又能筛选蛋白－DNA相互作用的酵母单双杂交系统（one-two-hybidsystem）等，但应用都没有双杂交系统广泛。酵母单半杂交系统01近几年来，以双杂交思想为基础建立起来的三杂交系统（three-bindinghybidsystem）可用来研究多至三个分子间的相互作用。两个蛋白之间通过第三者发生相互作用，第三物可以是蛋白质、小分子、或RNA。酵母三杂交系统02三杂交系统两个蛋白之间通过第三种成分，如：联结蛋白、修饰酶、RNA或小分子量的化合物构建了三杂交系统。在酵母三杂交系统的最初实验中，糖皮质激素受体与地塞米松FK506联结用于捕捉FK506结合蛋白。0201反向双杂交系统反向双杂交系统提供了简便的鉴定阻断蛋白间相互作用的方法。这项技术的关键是报道基因URA3的引入。URA3基因在这里起到了反向选择的作用，它编码尿嘧啶合成的关键酶，同时它又可催化5-氟乳清酸（5-FOA）转化为对细胞有毒的物质。Vidal等将URA3基因的启动子内引入GAL4的结合位点，从而改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择培养基上只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。而在含有5-FOA的完全培养基上“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。如果目的蛋白，即与BD或AD融合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用，URA3基因不能表达，则细胞能在含有5-FOA的完全培养基上生长。因此可通过筛选5-FOA抗性克隆从随即突变库中鉴定出下调蛋白相互作用的突变体。反向双杂交系统可更有效地反应蛋白质间作用的位点或起决定作用的个别氨基酸，进而分析蛋白结构和功能的关系。无核双杂交系统经典的酵母双杂交系统局限性之一是不适合转膜蛋白的相互作用。现在，在基因组范围内的酵母双杂交对转膜蛋白的研究甚少，近几年来，其他几种酵母双杂交系统已经鉴定了膜蛋白和细胞质蛋白相联系的蛋白质的相互作用。其中包括反向Ras补充系统，G蛋白融合方法和分离泛素膜蛋白酵母双杂交技术。酵母双杂交技术应用的趋势及展望”酵母双杂交技术问世十多年来，已经在蛋白质间的相互作用研究、筛选新的蛋白、研究蛋白质的功能等诸多方面发挥了重要作用。据估计，目前发表的研究蛋白质相互作用的文献中超过一半的发现来源于酵母双杂交实验。该技术已经成为许多实验室研究蛋白质的相互作用和蛋白质的结构与功能的必备手段。PUBMED搜索“yeasttwohybrid”目前，相当一部分的实验已经把重点放在如何利用双杂交系统作为媒介来研究蛋白相互作用的调控机制以及寻找蛋白质作用图谱，这在后基因组时代更具意义。1989年～2005年1234基因敲除技术反义RNA技术转座子标签T-DNA标签基因敲除01基因陷阱02030405基因功能研究的主要策略NowIwanttoexplainhowyoucangofishingwiththeYeasttwo-hybrids