质粒DNA的提取、酶切与电泳.pptVIP

优点：可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。（3）聚乙二醇（PEG）实验题目质粒DNA的提取、酶切与电泳主讲：生物实验教学中心主要内容前言一、核酸分离、纯化原则（一）保持核酸分子一级结构的完整性（二）防止核酸的生物降解二、分离提取核酸的主要步骤（一）细胞的破碎（二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除（三）核酸的沉淀(四）核酸的浓度测定（五）核酸的保存核酸（nucleicacid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。01Home02前言一、核酸分离、纯化原则（一）保持核酸分子一级结构的完整性1意义遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。2分离核酸原则：1）温度不要过高；2）控制一定的pH值范围(pH值5-9);3）保持一定的离子强度;4）减少物理因素对核酸降解的机械剪切力.Home细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。01所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。02（二）防止核酸的生物降解01021）金属离子螯合剂：如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉；2）阴离于型表面活性剂：1DNA酶抑制剂2RNA酶（RNAase)抑制剂RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。皂土（bentonite）作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。010302(2)DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用注意：1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。2）容易降解，保存在4℃或液氮中；3）提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。4）剧毒。肝素复合硅酸盐（Macaloid)RNase阻抑蛋白（RNasin）氧钒核糖核苷复合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)01Home02二分离提取核酸的主要步骤（一）细胞的破碎1高速组织捣碎机捣碎2玻璃匀浆器匀浆3超声波处理法4液氮研磨法5化学处理法(SDS、LDS，吐温80等）6生化法（溶菌酶、纤维素酶等）Home核蛋白的解聚、变性蛋白的去除01核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。02分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。03常用方法：加入浓盐溶液（如NaCl）核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。321酚/氯仿抽提使用酚时应注意Home酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。安全操作酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。使用注意贰壹沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点：改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。（三）核酸的沉淀1核酸沉淀的盐类及浓度盐贮存液浓度（