蛋白质组学技术.ppt

个或不到一个皮摩尔（pmol），鉴定方法的灵敏度必须高于这一要求。其二，传统方法通常都是对个别和几个蛋白质进行分析鉴定，而蛋白质组研究中要求同时对几十个、几百个甚至上千个蛋白质进行鉴定，因而对鉴定方法的通量和速度的要求要大大超过传统方法。目前蛋白质组学研究中的蛋白质鉴定技术的第三个特点是将实验结果与数据库查寻紧密关联。随着人类基因组计划而建立起来的人类基因组数据库和相关蛋白质数据库及相应的分析查寻软件，是目前人类疾病相关的蛋白质组研究必不可少的手段。所谓对蛋白质组研究中展现的蛋白质进行鉴定或注释，就第31页，共66页，星期日，2025年，2月5日是把展现的某个蛋白质点或一个组分的名称和它在数据库中的进入名码（accessioncode）确定下来，或者鉴定出其是否为数据库中未曾鉴定过的新蛋白质。某种意义上说，注释和鉴定是将蛋白质氨基酸序列与基因的DNA序列联系起来。如果该种基因编码的蛋白质有已知的确定的功能，那么注释和鉴定则可把蛋白质氨基酸序列与其生物学活性联系起来，这也是蛋白质组研究最重要的目的之一。（二）质谱技术质谱仪一般由进样器、离子化源、质量分析器、离子检测器、控制电脑及数据分析系统组成，其中离子化源和质量第32页，共66页，星期日，2025年，2月5日分析器是两个关键的部件，用于生物大分子研究的质谱仪的离子化源主要是电喷雾（ESI）和基质辅助激光解吸附离子化源（MALDI），而质量分析器则主要有四级杆，离子肼和飞行时间三种。当前市面上质谱仪中ESI源多与四级杆，离子肼质量分析器相匹配，而MALDI源常与飞行时间质量分析器相匹配。当前在蛋白质组研究中用质谱技术鉴定和注释蛋白质主要通过两种路线，一种是通过肽质谱指纹图（peptidemassfingerprinting）和数据库搜寻匹配的路线，进行这种分析的质谱仪首选是MALDI-TOF质谱仪；另一种是通过测出第33页，共66页，星期日，2025年，2月5日样品中部分肽段二级质谱信息或氨基酸序列标签与数据库搜寻匹配的路线，适合于进行这种分析的仪器主要是电喷雾串联质谱仪。由于当前蛋白质组研究中2-D胶电泳仍然是分离蛋白质的主导技术，对2-D胶上蛋白质点的鉴定，目前普遍认为MALDI-TOF质谱仪进行肽质谱指纹图（PMF）分析是合适的第一步。而MALDI-TOF质谱仪由于其灵敏度高（可达fmol），分析速度快，谱图易于解析以及受缓冲液/盐分的干扰小等诸多优点，非常适合于进行PMF分析。然而单靠PMF路线来鉴定蛋白质并非总能获得成功，经常第34页，共66页，星期日，2025年，2月5日有获得的肽质谱指纹图在数据库中得不到可靠的匹配的情况。其可能的原因有：①由于样品量太少，PMF图的信噪比太低、因而输入库中搜寻的数据质量不好。②2-D胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质，所获得的PMF图实际上是两个以上蛋白质PMF图的混合图。③操作中角蛋白或其他蛋白质的污染。④该蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中未有记载。⑤所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自融片段多。⑥所分析的蛋白质是一个数据库中没有的未知的新蛋白质。⑦有些生物材料的蛋白质数据库规模太小。在上述情况下PMF方法未能鉴定的蛋白质可通过其第35页，共66页，星期日，2025年，2月5日他质谱技术获得该蛋白质一段或数段多肽的串联质谱信息或序列标签（Sequencetag）并将其输入数据库中进行搜寻来鉴定该蛋白质。（三）基质辅助激光解吸电离技术（MALDI）在质谱分析中，为了测定待测物分子的质量，首先必须在系统中导入能量，而能量的导入必须满足以下两点要求：第一，能量能有效并受控制地转换到样品中以使样品分子充分地解吸附并离子化；第二，为避免热不稳定性物质的热降解，能量必须在非常短的时间内导入。激光具有脉冲短、灵敏度高的特点，是一种较理想的能量导入方式。早第36页，共66页，星期日，2025年，2月5日在20世纪60年代初期，激光就被科学工作者用来在质谱分析中产生离子，他们将具有不同波长和不同脉冲宽度的激光与各种不同类型的质谱结合进行研究。20世纪70年代初期首次用激光产生有机分子离子，但在20年以后，激光才用于大分子物质的解吸和电离。这一突破性的进展关键在于基质辅助激光解吸离子化技术的创立。在基质辅助激光解吸电离技术中，采用了一种小分子物质即基质帮助大分子物质进入气相。当基质以较高的比例与样品混合后，高分子待测样品便以单分子状态均匀地分散于基质中，在所采用的激光波长下，由于基质对激光有较第37页，共66页，星期日，2025年，2月5日强的吸收，而待测物只吸收很弱的激光，故不会造成大分子物质的破坏和降解。当大量被激发的基质分子由于热释放而挥发时，会同时将非挥发性的大分子待测物质带入气相