TNAIA 0351-2024 葡萄酒中布鲁塞尔酒香酵母的检测实时荧光PCR法.docx

ICS67.160.10

CCSC151

T/NAIA

团 体 标 准

T/NAIA0351-2024

葡萄酒中布鲁塞尔酒香酵母的检测实时荧光PCR法

IdentificationofDekkerabruxellensisinwineReal-timePCRmethod??

2024-12-25发布 2025-01-01实施

宁夏化学分析测试协会??发布

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前 言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。

本文件起草单位：宁夏回族自治区食品检测研究院、宁夏计量质量检验检测研究院、银川海关技术中心。

本文件主要起草人：岳苑、吕毅、冯秀娟、何淑桢、苏洋、高俊峰、姚博伟，魏嘉雯、贺生芳。

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葡萄酒中布鲁塞尔酒香酵母的检测

实时荧光PCR法

范围

本文件规定了葡萄酒中布鲁塞尔德克酵母的实时荧光PCR检测方法。

本文件适用于葡萄酒中布鲁塞尔德克酵母的Taqman探针实时荧光PCR定性检测。检出限（LOD）1%（质量分数）。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法。

GB/T27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测。

术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

实时荧光PCR Real-timePCR

在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。

Ct值 Cyclethreshold

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

试剂与材料

除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

引物与探针

引物：5′-GGATGGGTGCACCTGGTTTACAC-3′

5′-GAAGGGCCACATTCACGAACCCCG-3′

探针：FAM-ATATGGCTCCCAGAACCGATGCTGGCCC-BHQ1

真菌基因组DNA提取试剂盒：提取步骤及使用注意事项参见附录A。

荧光定量PCR反应预混液。

1.5mL离心管，50mL离心管，PCR八联管。

微量可调移液器配制吸头：10μL，100μL，1000μL。

仪器设备

5.1 培养箱：28℃±1℃

高压灭菌锅。

实时荧光PCR仪。

高速离心机（12000r/min）。

核酸蛋白测定仪。

微量可调移液器：量程0.5μL～10μL；量程10μL～100μL；量程100μL～1000μL。

恒温加热器。

分析天平（感量0.1mg）。

无菌玻璃器皿。

操作方法

样本富集

在样本制备区进行。取45mL酒样置于具有无菌螺旋塞的50mL离心管中，9000r/min离心5min，弃上清液。

模板DNA的制备

采用等效的真菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。操作过程按试剂盒进行。

实时荧光PCR检测

扩增试剂准备

在进行实际样品检测时，应设立空白对照、阴性对照和阳性对照实验。实时荧光PCR反应体系见表1。从荧光定量PCR反应预混液中取出相应的实时荧光PCR反应用试剂，融化后，瞬时离心5s后再用。每个样品设置2个平行重复。

表1 实时荧光PCR反应体系

试剂成分

体积(μL)

2×预混液

12.5

引物混合液

1

探针

1

样品DNAddH2O

1

至25

注1：空白对照实验时，用ddH2O替代样品DNA。

注2：阴性对照实验时，用非目标源性成分替代样品DNA。

注3：阳性对照实验时，用相应布鲁塞尔德克酵母的DNA替代样品DNA。

实时荧光PCR反应程序

实时荧光PCR反应参数为：95℃30s；95℃5s、60℃30s，40个循环，在每次循环的退火时收集荧光。检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。

结果判定与表述

质量控制

以下条件有一条不满足时,试验视为无效:

空白对照：无FAM荧光信号检出，Ct值≥40.0；

阴性对照：无FAM荧光信号检出，Ct值≥40.0；

阳性对照：有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct值≤35.0；

结果判定

在符合9.1的情况下，检测结果如下判定：

如Ct值≤35.0，则判定