TNAIA 0352-2024 植物源性食品中番茄源性成分的检测实时荧光PCR法.docx

ICS67.050

CCSA032

T/NAIA

团 体 标 准

T/NAIA0352-2024

植物源性食品中番茄源性成分的检测实时荧光PCR法

IdentificationoftomatoingredientsinfoodsofplantoriginReal-timePCRmethod

2024-12-25发布 2025-01-01实施

宁夏化学分析测试协会??发布

T/NAIA0352-2024

T/NAIA0352-2024

I

I

前 言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。

本文件起草单位：宁夏回族自治区食品检测研究院、宁夏计量质量检验检测研究院、银川海关技术中心。

本文件主要起草人：岳苑、冯秀娟、何淑桢、苏洋、高俊峰、姚博伟，魏嘉雯、贺生芳。

T/NAIA0352-2024

T/NAIA0352-2024

PAGE

PAGE1

植物源性食品中番茄源性成分的检测实时荧光PCR法

范围

本文件规定了植物源性食品中番茄源性成分的实时荧光PCR检测方法。

本文件适用于植物源性食品中番茄源性成分的Taqman探针实时荧光PCR定性检测。检出限（LOD）1%（质量分数）。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测

术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

实时荧光PCR Real-timePCR

在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。

Ct值 Cyclethreshold

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

原理

提取试样中基因组DNA，以DNA为模板，利用番茄特异性引物及探针进行实时荧光PCR扩增检测，同时设置阳性、阴性及空白对照。根据扩增的Ct值，判定试样中是否含有番茄源性成分。

试剂与材料

除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

引物与探针

内参照（18SrRNA）

引物：5′-CCTGAGAAACGGCTACCA-3′5′-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3′

探针：VIC-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-BHQ1

番茄源性成分

引物：5′-AGACCACGAGAACGATATTTGC-3′5′-TTCTTGCCTTTTCATATCCAGACA-3′

探针：FAM-CTCTTTGCAGTCCTCCCTTGGGCT-BHQ1

植物基因组DNA提取试剂盒：提取步骤及使用注意事项参见附录A。

荧光定量PCR反应预混液

1.5mL离心管，PCR八联管。

微量可调移液器配制吸头：10μL，100μL，1000μL。

仪器设备

实时荧光PCR仪。

高速离心机（12000r/min）。

核酸蛋白测定仪。

微量可调移液器：量程0.5μL～10μL；量程10μL～100μL；量程100μL～1000μL。

恒温加热器。

分析天平（感量0.1mg）。

高压灭菌器。

干热灭菌器。

检验步骤

样品前处理

总则

对样品进行前处理，处理后的样品分成三等，包括待检样品、复检样品、留存样品。

制备

固态样粉碎后收集到50mL离心管或密封袋中，半固态与液态混匀后分装于50mL离心管或密封袋中，

4～8℃保存。

DNA提取

在样本制备区进行，采用等效的植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。每个样品应制备2个测试样品提取DNA。

DNA浓度测定和定量

将DNA溶液做适当稀释,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值。1OD260nm=50μg/mL双链DNA或38μg/mL单链DNA。DNA的浓度按照式(1)计算，当OD260/OD280比值在1.5~2.1之间时，适宜于PCR扩增。扩增前将所有样品DNA稀释至10ng/uL~50ng/μL。

??×??×50

式中：

??=

1000 ………………（1）

C——DNA浓度，单位为ng/μLA——260nm处的吸光值N——稀释倍数

50——1OD260nm=50μg/mL双链DNA

实时荧光PCR检测

扩增试剂准备

在进行实际样品检测时，应设立空白对照、阴性对