基因工程的酶学基础.pptVIP

（2）主要用途①3’端补平5’5’klenow补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端，修复带裂口的DNA②DNA3’末端标记在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。klenow限制性内切酶切3’隐蔽末端的DNA片断Klenowfragment补平根据末端的序列选择一种?-32P-dNTPs末端标记的DNA5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI?-32P-dATP?-32P-dGTP25oC1hcDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow5’3’3’5’5’3’引物（1）T4DNA聚合酶的性质3.T4DNA聚合酶从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。有5’?3’聚合酶活性和3’?5’外切酶活性（降解单链更快）。①来源②酶活性③特点当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’?5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶无dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’用3’?5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端。再利用它的5’?3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的32P-dNTP。标记的dNTP逐渐取代被删除掉的原有的核苷酸，因此叫做取代合成。标记末端（取代合成法）补平3’隐蔽末端将双链DNA的3’粘末端转化为平末端DNA3’末端标记（2）T4DNA聚合酶的用途具EcoRI位点的DNA分子对DNA分子3’端有控制的降解合成作用产生选择性标记T4DNA聚合酶的取代合成法标记DNA片段来源从T7噬菌体感染的大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：有5’?3’聚合酶和3’?5’外切酶活性。T7基因5编码的大亚基：硫氧还蛋白。增加大亚基对模板的亲和性。大肠杆菌编码的小亚基：4.T7DNA聚合酶T7DNA聚合酶的特点一旦与模板结合就会不间断地合成互补链，合成DNA长度大。持续合成能力强为Klenow片段的1000倍3’?5’外切酶活性很高其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍合成不受DNA二级结构的影响01进行末端标记02催化大分子模板的DNA合成03如M1304补平隐蔽末端05T7DNA聚合酶的用途06取代合成法标记3’末端。07与T4DNA聚合酶相同。08合成补平3’隐蔽末端；水解修平3’突出末端。修饰后的T7DNA聚合酶T7DNA聚合酶的化学修饰去除3’?5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。更有效地补平末端修饰后的T7DNA聚合酶的用途双脱氧法进行长片段DNA测序的理想用酶，“测序酶”标记DNA3’隐蔽末端来源最早来源于水生栖热菌耐热的、依赖DNA的DNA聚合酶。TaqDNA聚合酶的性质无校正功能，高保真酶-PfuDNA聚合酶b.PCR产物可以进行T-A克隆应用PCR，最适反应温度75-80℃，150bp/s0103026.TaqDNA聚合酶7.反转录酶最普遍使用的是来源于禽类成髓细胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）：依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。（1）来源（2）AMV的性质由?和?两条多肽链组成。RNA肿瘤病毒。是影响限制酶活性的重要因素。5.缓冲液(Buffer)缓冲液的化学组成：10XbufferMgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：防止酶的氧化，保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：提高溶液中蛋白质的浓度，防止酶失活；商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。01当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识