DB37T 2037-2012 牛白细胞黏附缺陷症(BLAD)基因分子检测技术规程　.docxVIP

ICS11.220B41

DB37

山东省地方标准DB37/T2037—2012

牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）基因分子检测技术规程

TechnicalSpecificationofMolecularDetectionforBovineLeukocyteAdhesionDeficiency(BLAD)Gene

2012-02-09发布2012-03-01实施

山东省质量技术监督局发布

I

DB37/T2037—2012

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。

本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜牧总站、山东奥克斯生物技术有限公司、济南佳宝乳业有限公司。

本标准主要起草人：黄金明、张思聪、鞠志花、李秋玲、李建斌、李荣岭、王长法、赵鲲、侯明海、曲绪仙、仲跻峰。

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DB37/T2037—2012

牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）基因分子检测技术规程

1范围

本标准规定了牛BLAD分子检测的技术方法。本标准适用于牛BLAD分子检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T

6682

分析实验室用水规格和实验方法

NY/T

1672

绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程

SN/T

1193

基因检验实验室技术要求

SN/T1917-2007牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

牛白细胞粘附缺陷症（BLAD）

是由常染色体上的白细胞表面整合素（CD18）基因编码区第383位碱基发生A→G错义突变引起的隐性遗传缺陷病。

4检测原理

牛BLAD发病原因是由于CD18亚单位编码区的383位碱基由A突变为G引起的。基于该点突变设计引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行测序分析，根据DNA测序的峰图及碱基序列比对结果，判断其基因型，确认是否携带BLAD基因。

5主要试剂配制

除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的双蒸水；高压灭菌条件为1.034×105

Pa压力，蒸汽灭菌20min。试剂配制见附录A。

6主要仪器设备

见附录B。

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DB37/T2037—2012

7检测方法

7.1样本采集

静脉采集血样3～5mL，ACD抗凝，4℃或-20℃保存。对公牛，亦可采集2～3剂细管精液，液氮保存。7.2DNA提取

7.2.1血液DNA的提取

用酚-氯仿抽提法从抗凝血或者血凝块中提取基因组DNA。抗凝血和血凝块的预处理按照SN/T1917-2007的规定执行。DNA的提取按照NY/T1672-2008中的规定执行。也可用商业化DNA提取试剂盒提取DNA。

7.2.2精液DNA提取

从细管中取出精液放入1.5mL离心管中，然后，加入500μL生理盐水，混匀，除去卵黄稀释液及精清等蛋白成份；12000rpm离心1min，弃除废液，保留底部的白色沉淀。重复上述步骤一次。加入精子DNA抽提液400μL及5μL蛋白酶K，旋涡混合器悬浮；56℃消化10～12h，至溶液澄清透明；加入300μL苯酚，轻轻混匀，12000rpm离心10min；吸取上清液，转至1.5mL离心管中，加入150μL酚和150μL氯仿，轻轻混匀5min；吸取上清液，加入500μL无水乙醇（4℃保存），轻轻颠倒混合；用灭菌枪头将白色沉淀挑出，1mL的70%乙醇洗涤，凉干，加入400μL双蒸水，充分溶解，4℃或-20℃保存。

7.2.3DNA浓度和纯度检测

按照NY/T1672的规定执行。

7.3引物序列

上游引物：5′-ATTGACAAGGAAAGAAGTCGTTAC-3′;下游引物：5′-CTGGCACTCCTTCTCCTTGTT-3′。

扩增产物为874bp。

7.4PCR扩增

7.4.1PCR扩增体系

25μL反应体系：10×Buffer2.5μL、50mmol/LMgCl21.2μL、10mmol/LdNTP0.6μL、TaqDNA聚合酶2U、10μmol/L引物各1.0μL、模板DNA50～100ng，加双蒸水至总体积25μL。

7.4.2PCR扩增循环参数

94℃预变性5min；94℃变性