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免疫共沉淀与WesternBlot

实验步骤:

1．以60mm细胞培养皿为例，细胞转染后24－36小时后，吸净培养液（可用PBS

小心漂洗一次）。

2．加入500μl预冷的1×lysisbuffer,于4℃或冰上放置裂解细胞5分钟。

3．将细胞裂解液转移到1.5mleppondorf管内，于冷冻离心机4℃，13000g离心30

分钟。

4．将离心后的上清液分为两份：一份35μl，加入等体积的2×SDSsamplebuffer,混

匀后于100℃煮10分钟，做为总细胞裂解液（totalcelllysate，TCL）于－20℃

保存，或取6－10μl进行SDS－PAGE电泳，Westernblot检测目的蛋白的表达

水平（接第5步）。另一份用于免疫沉淀，具体操作如下：

1）分A/Gbeads：按每管（一个免疫沉淀样品）加入5μlAgroseA/Gbeads

及5μl（1μg）抗体计算一次实验所用beads及抗体的总量，将抗体和beads混

合，补充lysisbuffer（补充的lysisbuffer的量能使每管能均匀分配到50μlbeads

及抗体的混合物），将beads及抗体的混合物按每管50μl（含5μlbeads及5μl抗

体）分配到1.5mlEppendorf管中，再加入400μl1×lysisbuffer，备用；

2）从步骤4中另一份用于免疫沉淀的上清液中取400μl加入到上一步（步骤

1））已分好的beads中，使终体积达到850μl，将管子固定到混匀器上使混匀器

匀速旋转（15rpm）免疫沉淀3小时；

3）将免疫沉淀后的溶液于4℃3000rpm离心3分钟，去上清，加入500μl

1×lysisbuffer洗涤beads，于冷冻离心机4℃3000rpm离心3分钟，弃上清，共

洗涤三次。

4）最后一次洗涤完毕，弃上清，管中只剩Beads，加入35μl1×lysisbuffer与

等体积2×SDSsamplebuffer混合，于100℃煮沸10分钟，稍离心后取10μl左右

上样到PAGE胶，进行电泳，或－20℃冻存。

5．电泳完毕，取下PAGE胶，与PVDF膜做成三明治形状，用湿转法进行电转1

小时。

6．电转完毕，取下PVDF膜，加入5％脱脂奶粉，于脱色摇床摇荡（75rpm）封闭

1小时以消除非特异背景。

7．封闭完毕，用TBST洗掉牛奶，加入一抗，于脱色摇床摇荡孵育（75rpm）1

小时，使一抗与特异蛋白结合。

8．回收一抗，用TBST洗3次（75rpm），每次5－10分钟。

9．加入二抗，于脱色摇床孵育1小时，使二抗与一抗结合。

10．用TBST洗3次，每次5－10分钟。

11．将ECLA液和ECLB液各1ml，混匀，放入二抗孵育后的PVDF膜30秒，将

PVDF膜平铺于曝光盒中，进暗房，用医学X光胶片曝光。

12．经过显影、定影后的胶片，于室温下自然风干或烘干，描画蛋白marker便于分

析。

注：如只做WesternBlot，跳过步骤4即可。

实验试剂：

1．PBS：

NaCl20mM,KCL2.68mM,NaHP10mM,KHP1.76mM(pH7.4)，室温保

2424

存。

2．10×lysisbuffer：

Tris-HCl20mmol/L(pH7.5),NaCl150mM,EDTA1mM,EGTA1mM,Triton

X-1001%,Sodiumpyrophosphate2.5mM,β-Glycerrophosphate1mM,NaV4

1mM,Leupeptin1ug/ml,－20℃保存。（稀释成1×lysisbuffer后加入1mM

PMSF）

3．2×SDSsamplebuffer：

Tris-Cl（pH6.8）125mM，SDS4%，甘油20%，DTT100mM，溴酚兰0.02%，

室温保存。

4．分离胶（下层胶）（10%SDS）15ml：

30%丙烯酰胺5ml，10×lowerbuffer(pH8.8)1.5