DB37T 3104-2018 向日葵杂交种品种纯度SSR分子检测标准.docxVIP

ICS67.060

B21

DB37

山东省地方标准

DB37/T3104—2018

向日葵杂交种品种纯度SSR分子检测标准

ThevarietypurityidentificationtechniqueofsunflowerseedswithSSR

2018-02-02发布2018-03-02实施山东省质量技术监督局发布

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DB37/T3104—2018

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省农业厅提出。

本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。

本标准主要起草单位：山东农业大学、北京德农种业有限公司。本标准起草人：张春庆、赵洪春、郑建鹏、温大兴、李岩。

本标准为首次发布。

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DB37/T3104—2018

向日葵杂交种品种纯度SSR分子检测标准

1范围

本规程规定了SSR分子检测向日葵种子纯度的试剂配比、DNA提取、SSR引物选择、多重PCR方法、PCR产物检测等技术要求。

本规程适用于向日葵品种和杂交种种子纯度的室内快速鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB3543种子检验技术规程

GB20464农作物种子标签通则

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

杂交种

各种直接用于生产的杂交向日葵一代种子。

3.2

品种纯度

品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。

3.3

标准样品

能够充分代表种或品种特征特性的种子样品，或具备指定特征、特性样品。

3.4

引物

一条互补结合在模板DNA链上的短单链，能提供3-0H末端作为DNA合成的起始点，延伸合成模板DNA的互补链。

4原理

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从向日葵种子中提取DNA,利用SSR引物进行PCR扩增，不同碱基长度的PCR扩增引物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并通过染色显示DNA指纹谱带类型。不同向日葵品种由于遗传组成不同，基因组中DNA简单重复序列的重复次数有差异，这种差异可通过PCR扩增、电泳、染色程序获得的DNA指纹图谱加以区分，从而对不同品种进行鉴定。杂交种纯度鉴定时，可从附表中选取亲本有差异的SSR引物。品种纯度鉴定时，从附表中选择生产上常用品种间有差异的引物。

5仪器与试剂

5.1仪器

电子天平，水平摇床，双垂直板电泳槽，PCR仪，电泳仪，高压灭菌锅，观片灯。

5.2试剂

丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、谷氨酸、乙二胺四乙酸二钠、硼酸、过硫酸铵、四甲基乙二胺(TEMED)、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醛、2×PowerTaqPCRMasterMix、超纯水、SSR引物、硝酸银(所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水)。

6溶液

6.1提取液

称取0.56g氢氧化钾于100mL烧杯中，加去离子水溶解并定容至100mL,4℃贮存备用。

6.230%凝胶溶液

称取292g丙烯酰胺于1000mL烧杯中，加去离子水溶解，再加入8g甲叉双丙烯酰胺，溶解后定容至1000mL,4℃贮存备用。

6.35×TBE

称取54gTris、3.72g乙二胺四乙酸二钠、27.5g硼酸于1000mL烧杯中，溶解后定容至1000mL。

6.4催化剂

称取10g过硫酸胺于100mL烧杯中，加去离子水溶解并定容至100mL,4℃贮存备用。

6.5电极缓冲液

取5×TBE200mL,用去离子水定容至1000mL。

6.6染色液

称取1g硝酸银溶于500mL去离子水中。

6.7显色液

称取10g氢氧化钠溶于500mL去离子水中，用时加2mL甲醛。

7操作程序

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7.1DNA提取

从送验样品中随机数取向日葵种子200粒，将种子剥壳后纵切，放入1.5mL离心管中，加入300μL提取液，提取时间1min~24h均可，使用前混匀、静止5分钟、离心3000rpm,0.5min,取上清即为DNA样品，用于PCR扩增时DNA样品模板量为2μL。

7.2扩增体系

采用20μL扩增体系，其中每对U-primers的上下游引物(10μM)各0.5μL,2μL25mmol/LMgCl?,0.2μL5U