DB37T 3087-2017 猪伪狂犬病病毒gE基因PCR检测技术.docxVIP

ICS65.020.30

B41

DB37

山东省地方标准

DB37/T3087—2017

猪伪狂犬病病毒gE基因PCR检测技术

PCRAssayforDetectionofPseudorabiesvirusgEgene

2017-12-29发布2018-01-29实施

山东省质量技术监督局发布

I

DB37/T3087—2017

前言

本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。

本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。

本标准主要起草人：陈蕾、杜以军、齐静、丛晓燕、孙文博、陈智、郭立辉、于江、吴家强、李俊、时建立。

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DB37/T3087—2017

猪伪狂犬病病毒gE基因PCR检测技术

1范围

本标准规定了猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因PCR检测技术的操作要求。本标准适用于PRV的实验室诊断、监测和流行病学调查等。

2实验室生物安全要求

实验室必须为生物安全Ⅱ级(BSL-2级)及以上实验室。

3规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

4术语与定义

下列术语与定义适用于本标准。

4.1

PCR

聚合酶链式反应。

4.2

SDS

十二烷基硫酸钠。

5仪器设备和试剂

5.1仪器设备

5.1.1微量移液器(最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL),带滤芯的枪头。

5.1.220000r/min低温高速离心机。

5.1.3电热恒温水槽。

5.1.4稳流稳压电泳仪。

5.1.5水平电泳槽。

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DB37/T3087—2017

5.1.6凝胶成像系统。

5.1.7紫外透射反射分析仪。

5.1.8电磁炉。

5.1.9烧杯(1000mL)。

5.1.10电子天平精度为：0.001g。

5.1.11PCR扩增仪。

5.1.12组织匀浆器或研钵。

5.1.13-20℃冰柜。

5.1.142℃~8℃冰箱。

5.2试剂

除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。

5.2.1蛋白酶K(见附录A.1)。

5.2.210%SDS液(见附录A.2)。

5.2.370%乙醇(见附录A.3)。

5.2.41.0%琼脂糖凝胶(见附录A.4)。

5.2.5DNAMarker2000。

5.2.6超纯水：符合GB/T6682,三级。

5.2.7引物：

PRV-Fwd:5-CTGGCTCTGCGTGCTGTG-3;

PRV-Rev:5-GGTCCATTCGTCACTTCCG-3;扩增片段长度348bp。

6操作程序

6.1样品的采集和处理

6.1.1样品的采集

临床上猪的脑组织、淋巴结等，置于-20℃冰柜或液氮中保存。

6.1.2样品的处理

6.1.2.1取猪的脑组织、淋巴结等约5g于研钵中，用剪刀剪碎，加入2mLPBS缓冲液，研磨。

6.1.2.2阳性对照处理：含有PRVgE基因的DNA。

6.1.2.3阴性对照处理：灭菌双蒸水。

6.2DNA的提取

用蛋白酶K裂解法提取总DNA。

6.2.1取研磨液500μL于1.5mL离心管中，加入50μg/mL的蛋白酶K5μL,加入10%的SDS溶液25μL,55℃水浴2h～3h。

6.2.2加入200μLTris饱和酚，充分混匀，10000g离心15min。

6.2.3取上清于一新的离心管中，加入200μLTris饱和酚和200μL氯仿，10000g离心15min。

6.2.4取上清于一新离心管中，加入200μL氯仿，10000g离心15min。

6.2.5取上清于一新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置20min,10000g