DB37T 3085-2017 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株的RT-PCR鉴别检测技术　　.docxVIP

ICS65.020.30

B41

DB37

山东省地方标准

DB37/T3085—2017

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株的RT-PCR鉴别检测技术

IdentificationofhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusstrainandclassicalstrainbyRT-PCR

2017-12-29发布2018-01-29实施

山东省质量技术监督局发布

I

DB37/T3085—2017

前言

本标准由山东省畜牧兽医局提出。

本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。

本标准主要起草人：杜以军、齐静、丛晓燕、陈蕾、孙文博、陈智、郭立辉、于江、吴家强、李俊、时建立。

1

DB37/T3085—2017

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株的RT-PCR鉴别检测技术

1范围

本标准规定了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株的RT-PCR鉴别检测技术的操作要求。本标准适用于高致病性及经典猪繁殖与呼吸综合征的实验室诊断、监测和流行病学调查等。

2实验室生物安全要求

实验室必须为生物安全Ⅱ级(BSL-2级)及以上实验室。

3规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

4术语与定义

下列术语与定义适用于本标准。

4.1

PCR

聚合酶链式反应。

4.2

SDS

十二烷基硫酸钠。

5仪器设备和试剂

5.1仪器设备

5.1.1微量移液器(最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL),带滤芯的枪头。

5.1.220000r/min低温高速离心机。

5.1.3电热恒温水槽。

5.1.4稳流稳压电泳仪。

5.1.5水平电泳槽。

2

DB37/T3085—2017

5.1.6凝胶成像系统。

5.1.7紫外透射反射分析仪。

5.1.8电磁炉。

5.1.9烧杯(1000mL)。

5.1.10电子天平精度为：0.001g。

5.1.11PCR扩增仪。

5.1.12组织匀浆器或研钵。

5.1.13-20℃冰柜。

5.1.142℃~8℃冰箱。

5.2试剂

除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。

5.2.1Trizol。

5.2.2氯仿。

5.2.375%乙醇。

5.2.4异丙醇。

5.2.5AMV反转录酶(200U/μL)。

5.2.6RNA酶抑制剂(40U/μL)。

5.2.7TaqDNA聚合酶(5U/μL)。

5.2.81.0%琼脂糖凝胶：见附录A.1。

5.2.950×TAE缓冲液：见附录A.2.1和A.2.2。

5.2.10焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水：见附录A.3。

5.2.11DNA分子量标准DL2000。

5.2.12超纯水：符合GB/T6682,三级。

5.2.13引物：

上游引物P1:5-AAAGAYCAGATGGAGGAG-3;

下游引物P2:5-TRATGGCTTGAGCTGAG-3;斜体代表兼并碱基；

经典毒株扩增片段长度大小为766bp,高致病性毒株扩增基因片段大小为676bp。

6操作程序

6.1样品的采集和处理

6.1.1样品的采集

临床上猪的脾、肺、淋巴结、血液等，置于-20℃冰柜或液氮中保存。

6.1.2样品的处理

6.1.2.1取猪的脾、肺、淋巴结等组织约5g于研钵中，用剪刀剪碎，加入2mLPBS缓冲液，研磨；血液3000r/min离心5min,分离血清。

6.1.2.2阳性对照处理：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株的疫苗株和经典毒株的疫苗株。

6.1.2.3阴性对照处理：灭菌双蒸水。

6.2RNA的提取-Trizol法

3

D