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无机盐加入量配制一系列不同硫酸铵饱和度的蛋白质溶液，离心除蛋白，测定上清液蛋白浓度。无机盐添加方式连续（需盐量多）高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀，若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀作用。ACB低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低。较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相当于25mg/mL～30mg/mL。蛋白质浓度要将盐析分布曲线重叠的两个蛋白质分级沉淀：稀释后可能分级。温度T在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随温度升高而增加。高盐常相反一般情况下，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。溶液pHpH影响Cohnx方程中的?值。01在等电点处溶解度小，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。02如从酵母中提取细胞色素C：01离子交换后，洗脱液加85%(NH4)2SO4，02，产生杂蛋白沉淀，除杂蛋白，03上清液调，产生细胞色素C沉淀。04盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐才能进一步精提纯。脱盐常用透析法。透析是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在半透膜（玻璃纸、火绵纸等）制的透析袋里放在蒸馏水中进行，可不断更换蒸馏水，直至杂质被除去。透析袋蛋白质溶液蒸馏水有机溶剂沉淀法有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其原理主要是：降低水的介电常数，使蛋白质分子水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。01从沉淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便，可透析，而且有机溶剂本身可部分地作为蛋白质的杀菌剂。02优点：缺点：01耗用大量溶剂，试剂易燃，有毒对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。收率也比盐析法低；02有机溶剂的种类：乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀pro。有机溶剂浓度的计算可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。影响因素及控制温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此必须预冷，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。在乙醇沉淀人血浆蛋白时，温度控制在-10?C下进行。一般蛋白质0℃，有机溶剂-10℃加入。但淀粉酶10-15℃。有机溶剂浓度同盐析一样，随着有机溶剂浓度的上升，蛋白质溶解度也呈指数规律下降。如血纤维蛋白原的溶解度在乙醇浓度为8%时达到最大，而当乙醇浓度为40%时达到最小。01通常是选在等电点附近，也考虑样品稳定性。02很多酶pI在pH4-5，比稳定的pH低。pH值：01避免使用很稀的浓度。高浓度样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大。通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白质初浓度为宜。0203样品浓度：无机盐的离子强度

1通常盐浓度以不超过5％为宜，乙醇的量以不超过原蛋白质水溶液的２倍体积为宜。3通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。2少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了沉淀效果。Ca2+、Zn2+等与蛋白形成复合物，降低溶解度。01常用醋酸锌、硫酸锌。02金属离子沉淀所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，可以透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性。等电点沉淀法利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用。此法主要用于去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。等电点沉淀pH=pI净电荷为零,溶解度最小沉淀等电点沉淀法pI值通常在pH4~6范围内变化，一般用无机酸（如盐酸、磷酸和硫酸）作沉淀剂。010102缺点：无机酸会引起较大的蛋白质不可逆变性。02等电点沉淀除杂：胰岛素pH8.0除碱性杂蛋白，pH3.0除02四环素pI5.401酸