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WB实验原理及流程图

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目录

CONTENTS

01

WB实验原理

02

WB实验材料

03

WB实验步骤

04

WB实验注意事项

05

WB实验应用

06

WB实验流程图

01

WB实验原理

抗原抗体特异性结合

抗原与抗体的结合原理

基于抗体与抗原之间的特异性结合，这种结合具有高度的特异性和敏感性。

抗体种类与特点

抗原表位

包括单克隆抗体和多克隆抗体，具有高度的特异性和亲和力。

抗原分子上与抗体结合的特定区域，决定了抗原的特异性。

1

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蛋白分离与转移

蛋白样品制备

将蛋白质样品通过适当的处理，如细胞裂解、蛋白质提取等，获得可用于WB实验的样品。

凝胶电泳分离

利用蛋白质在电场中的迁移速率不同，将蛋白质分离成不同的条带。

转移至膜上

通过半干或湿转等方式，将凝胶上的蛋白质转移至固相支持物（如PVDF膜或硝酸纤维素膜）上。

免疫反应与检测

特异性抗体与膜上蛋白结合

将特异性抗体与膜上的蛋白质进行结合，形成抗原-抗体复合物。

03

02

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抗体与检测试剂结合

加入标记有酶或荧光染料的二抗，与特异性抗体结合，形成抗原-抗体-二抗复合物。

信号检测与结果分析

通过酶促反应或荧光信号检测，对膜上的复合物进行显色或发光，根据信号强弱判断目标蛋白的表达情况。

02

WB实验材料

蛋白样品制备

细胞或组织样品经过适当裂解处理后，得到蛋白质溶液。

蛋白样品与裂解液

裂解液选择

根据实验需求选择合适的裂解液，以保证蛋白质在裂解过程中的稳定性和溶解性。

蛋白质浓度测定

使用适当的方法进行蛋白质浓度测定，如BCA法或Bradford法。

电泳凝胶

配制适当浓度和pH值的电泳缓冲液，以保证电泳过程中蛋白质的迁移。

电泳缓冲液

转膜材料

选择适当的转膜材料，如硝酸纤维素膜或PVDF膜，以及相应的转膜缓冲液。

选择合适的电泳凝胶，如SDS凝胶，用于分离不同分子量的蛋白质。

电泳与转膜材料

抗体与显影试剂

一抗

选择与目标蛋白质特异性结合的一抗，包括单克隆抗体或多克隆抗体。

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04

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封闭液

用于封闭膜上的非特异性结合位点，降低背景信号。

二抗

选择与一抗结合的二抗，通常带有标记物如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

显影试剂

选择合适的显影试剂，如化学发光试剂或显色底物，用于检测抗体与目标蛋白质的结合情况。

03

WB实验步骤

使用适当的细胞裂解液，将细胞破碎并释放出蛋白质。

采用BCA法或Bradford法等测定蛋白质浓度，以确保每个样本的蛋白质含量一致。

将样品加入加热至95-100℃的样品缓冲液中，加热3-5分钟使蛋白质变性，便于SDS结合。

将处理好的蛋白质样品分装储存于-20℃或-80℃冰箱中备用。

蛋白提取与制备

细胞裂解

蛋白质浓度测定

蛋白质变性

制备样本

SDS电泳

凝胶制备

根据目标蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，制备SDS凝胶。

样品上样

将蛋白质样品按照预定顺序加入凝胶孔中，并加入分子量Marker作为参照。

电泳

在电场的作用下，蛋白质向正极移动，根据分子量大小分离蛋白质。

凝胶剥离

电泳结束后，将凝胶从电泳装置中剥离出来，准备进行下一步操作。

转膜与阻断

转膜

将凝胶上的蛋白质转移到PVDF或NC膜上，通常采用湿转或半干转的方法。

膜上蛋白质固定

将膜浸泡在甲醇或固定液中，使蛋白质牢固地结合在膜上。

阻断

使用含有非特异性蛋白的阻断液，封闭膜上的非特异性结合位点，减少背景噪音。

抗体孵育与显影

一抗孵育

将膜与特异性的一抗孵育一段时间，使一抗与膜上的目标蛋白结合。

二抗孵育

将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，使二抗与一抗结合。

显影

加入化学发光底物，通过化学反应使膜上的目标蛋白条带可视化。

结果分析

根据条带的强弱和位置，分析目标蛋白的表达情况。

04

WB实验注意事项

样品制备

确保样品在适当条件下制备，如使用专用试剂盒或溶液，避免污染和降解。

样品处理与保存

样品储存

样品应储存在适当温度下，避免反复冻融，以免蛋白质降解或修饰。

样品处理

样品处理时尽量避免使用高浓度盐或酸碱，以免破坏蛋白质的结构和功能。

抗体选择

根据实验要求，优化抗体的浓度和孵育时间，以达到最佳实验结果。

实验浓度

实验操作

严格按照实验步骤进行操作，注意洗涤次数和每次洗涤的缓冲液量。

选择与目的蛋白特异性高、灵敏度好的抗体，避免非特异性结合。

实验条件优化

结果分析与解读

结果判定

根据实验结果，判断目的蛋白的表达情况，包括蛋白的分子量、表达量和修饰状态。

数据分析

对实验结果进行量化分析，比较不同样品间的差异，并进行统计学检验。

结果解读

结合实验背景和目的，对实验结果进行合理解释，并提出可能的生物学意义。

05

WB实验应用

蛋白表达量检测

定量分析

通过WB实验可以检测样本中目标蛋白的表达量，进而进行