沉淀技术课件.pptVIP

（4）樣品濃度與鹽析相似，樣品較稀時增加了溶劑投入量和損耗，降低了溶質收率，還易產生稀釋變性，但共沉作用小，分離效果較好。反之，濃的樣品會增強共沉作用，降低解析度，然而減少了溶劑用量，提高了回收率，變性的危險性也小於稀溶液。一般認為蛋白質的初濃度以0.5%～2%為好，粘多糖則以1%～2%較合適。（5）金屬離子助沉作用在用溶劑沉澱生物高分子時還須注意到一些金屬離子如Zn2+，Ca2+等可與某些呈陰離子狀態的蛋白質形成複合物。這種複合物的溶解度大大降低而不影響生物活性，有利於沉澱形成，並降低溶劑耗量，0.005-0.02mol/L的Zn2+可使溶劑用量減少l/3至1/2，使用時要避免會與這些金屬離子形成難溶鹽的陰離子的存在(如磷酸根)。實際操作時往往先加溶媒沉澱除去雜蛋白，再加Zn2+沉澱目的物。4.4等電點沉澱法

等電點沉澱法在低的離子強度下，調pH至等電點，使蛋白質所帶淨電荷為零，降低了靜電斥力，而疏水力能使分子間相互吸引，形成沉澱的操作稱為等電點沉澱不同的兩性電解質具有不同的等電點，以此為基礎可進行分離。生產胰島素時，在粗提液中先調pH8.0去除鹼性蛋白質，再調pH3.0去除酸性蛋白質。

pH=pI蛋白質的離子化情況既與蛋白質的詳細結構有關，也與溶液的pH值有關。一般來說，溶液的pH值高，蛋白質帶負電；pH值低，蛋白質帶正電。當溶液的pH值為某一值時，蛋白質幾乎不帶電，即淨電荷為零，或者說它帶相等的正電荷和負電荷，這時的pH值稱為等電點，常用pI表示。兩性電解質在溶液中pH處於等電點pI時，分子表面靜電荷為零，導致賴以穩定的雙電層及水化膜削弱或破壞，分子間引力增加，溶解度降低並沉澱析出。①等電點沉澱法操作十分簡便，試劑消耗少，給體系引入的外來物(雜質)也少。是一種常用的分離純化方法，②收率低：但兩性溶質（蛋白質）在等電點附近（處）仍有一定的溶解度，(有時甚至比較大)，所以等電點沉澱往往不完全。即等電點沉澱法往往不能獲得高的回收率。等電點沉澱的特點：③解析度較低：許多分子的等電點比較接近，容易發生共沉澱，所以解析度較低。因此很少單獨使用等電點沉澱法作為主要純化手段，往往與鹽析，有機溶劑沉澱等方法結合使用，在實際應用種主要用於去雜蛋白。在蛋白質疏水性比較大和結合水比較小時的沉澱更有效。最大缺點：無機酸有引起較大的蛋白質不可逆變性的危險。鹽析過程當中性鹽加入蛋白質分散體系時可能出現以下兩種情況：（1）“鹽溶”現象(salt-in)—低鹽濃度下，增加蛋白質分子間靜電斥力，蛋白質溶解度增大。（2）“鹽析”現象(salt-out)—高鹽濃度下，中和電荷、破壞水化膜，蛋白質溶解度隨之下降。鹽析作用要強鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽必須是惰性的來源豐富、經濟1）鹽析用鹽的選擇鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉硫酸銨是最常用的蛋白質鹽析沉澱劑（1）價廉；（2）溶解度大，溫度係數小，許多蛋白質可以鹽析出來；（3）硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，（4）不易引起蛋白質變性。鹽析用鹽的選擇缺點：（1）水解變酸；（2）高pH釋氨，腐蝕；（3）殘留產品有影響。一般說來，離子強度越大，蛋白質的溶解度越低。在進行分離的時候，一般從低離子強度到高離子強度順次進行。每一組分被鹽析出來後，經過過濾或冷凍離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質組分鹽析出來。組成相近的蛋白質，分子量越大，沉澱所需鹽的量越少；蛋白質分子不對稱性越大，也越易沉澱。2）鹽濃度對鹽析效果的影響㏒S=β-ＫsＩS—蛋白質的溶解度，g/L;I－離子強度，I=1/2∑mizi2mi—離子i的摩爾濃度；Zi—所帶電荷β—常數，圖中截距Ks—鹽析常數，圖中直線斜率Cohn經驗式

蛋白質溶解度與鹽濃度的關係β和Ks的物理意義β—β代表截距，即當離子強度為零，也就是純水中的假想溶解度的對數。與蛋白質種類、溫度、pH值有關，與鹽無關；Ks—鹽析常數，代表圖中直線的斜率；從一些實驗結果表明，Ks與溫度和pH無關，但和蛋白質與鹽的種類有關。但這種變化不是很大，例如以硫酸銨作為沉澱劑時，Ks值對不同的蛋白質來說，其變化不會超過1倍。用鹽析法分離蛋白質的二種方法鹽析法分為兩類，第一類叫Ks分段鹽析法，在一定pH和溫度下通過改變離子強度實現，（固定pH,溫度，改變鹽濃度），由於蛋白質對離子強度的變化非常敏感，易產生共沉澱現象，用於早期的粗提液；第二種叫β分段鹽析法，在一定離子強度下通過改變PH和溫度來實現，（固定離子強度，改變pH及溫度），由於溶質溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此解析度更高，用於後期進一步分離純化和結晶。鹽析用