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2025年pcr实验室考试题简答题及答案

1.简述PCR实验室四区的功能划分及气流控制要求，并说明各区物品传递的基本原则。

答：PCR实验室通常划分为四个独立工作区域：试剂准备区（Ⅰ区）、样本处理区（Ⅱ区）、扩增反应体系配制区（Ⅲ区）、扩增及产物分析区（Ⅳ区）。

-试剂准备区（Ⅰ区）：用于储存、准备、分装PCR实验所需的主反应混合液（不含核酸模板），包括引物、dNTP、Taq酶等试剂的配制与分装。需配备超净工作台或生物安全柜，环境需无核酸污染。

-样本处理区（Ⅱ区）：用于临床样本的接收、编号、前处理（如离心、裂解）及核酸提取。需配备生物安全柜、高速离心机、核酸提取仪等设备，环境需严格避免交叉污染。

-扩增反应体系配制区（Ⅲ区）：将提取的核酸模板与主反应混合液进行混合，配制PCR反应体系。需与样本处理区物理隔离，避免模板污染。

-扩增及产物分析区（Ⅳ区）：进行PCR扩增反应（如荧光定量PCR仪运行）及扩增产物的检测（如凝胶电泳、测序等）。此区为高污染风险区，需与前区严格分隔。

气流控制要求：四区需形成单向气流，即Ⅰ区→Ⅱ区→Ⅲ区→Ⅳ区，压力梯度依次递减（如Ⅰ区为+10Pa，Ⅱ区为0Pa，Ⅲ区为-10Pa，Ⅳ区为-20Pa），避免含核酸的空气逆向流动污染前区。

物品传递原则：各区物品严格单向流动，禁止从后区（如Ⅳ区）向前区（如Ⅰ区）传递；试剂与耗材需经传递窗或缓冲间传入对应区域，使用后按生物废弃物处理；样本从Ⅱ区处理后，通过专用传递窗或固定路线传入Ⅲ区，扩增产物从Ⅳ区处理后直接进入废弃物处理流程。

2.列举PCR实验中常用的质量控制措施，并说明内参基因（内标）的作用及选择原则。

答：PCR实验常用质量控制措施包括：

（1）阴性对照：使用无核酸模板的反应体系（如用DEPC水代替模板），用于监测试剂或环境是否被核酸污染。

（2）阳性对照：使用已知浓度的标准品或阳性样本，用于验证反应体系的有效性及扩增效率。

（3）内参基因（内标）：在同一反应体系中加入与靶基因扩增效率相近的内源性或外源性基因，用于监控样本处理（如核酸提取效率）、扩增过程是否正常，避免假阴性结果。

（4）重复性试验：对同一样本进行平行检测，评估实验的稳定性。

（5）梯度稀释验证：通过标准品的梯度稀释绘制标准曲线，验证扩增效率（理想范围90%-110%）及线性范围。

内参基因的作用：

-校正核酸提取过程中的损失（如样本裂解不充分、核酸吸附丢失），确保检测到的阴性结果非因提取失败导致。

-监控扩增反应体系的抑制物（如血红蛋白、胍盐残留）是否影响扩增效率。

-提高结果的可比性，尤其在多批次实验或不同实验室间数据比对时。

选择原则：

-内参基因需在待测样本中稳定表达（如人源样本常用β-actin、GAPDH等管家基因），或外源性内标需与靶基因无同源性，避免交叉扩增。

-扩增效率与靶基因一致（ΔCt≤0.5），避免因扩增效率差异导致校正偏差。

-拷贝数需与靶基因检测范围匹配，避免因浓度过高抑制靶基因扩增或过低无法检测。

3.简述PCR实验室污染的主要来源及防控措施，针对“扩增产物气溶胶污染”提出3项具体解决方案。

答：PCR实验室污染主要来源包括：

（1）样本间交叉污染：样本处理时移液器气溶胶、共用耗材（如吸头未换）导致的模板转移。

（2）扩增产物污染：PCR扩增后的高拷贝产物（10^6-10^9拷贝/μL）形成气溶胶，扩散至前区（如Ⅰ-Ⅲ区）。

（3）试剂污染：主反应混合液配制时引入的外源核酸（如试剂分装时操作不当）。

（4）实验室环境残留：台面、仪器表面、空气未彻底清洁，残留核酸片段。

防控措施：

-分区操作：严格遵循“单一流向”原则，各区物品、人员不交叉。

-物理隔离：各区设置独立空调系统，使用紫外灯（254nm）或臭氧发生器定期消毒（如每日实验后照射30分钟）。

-耗材管理：使用带滤芯吸头（防气溶胶吸头），一次性耗材即用即弃。

-酶与缓冲液优化：使用热启动Taq酶（减少非特异性扩增），添加UNG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）降解含dUTP的旧扩增产物。

针对扩增产物气溶胶污染的3项解决方案：

（1）分区气压控制：Ⅳ区设置为负压（相对于Ⅲ区-10Pa以上），并确保排风系统独立，避免气溶胶扩散至前区。

（2）紫外+化学消毒：在扩增仪、移液器等可能接触产物的设备表面，使用10%次氯酸钠溶液擦拭（破坏核酸磷酸二酯键），配合实验后30分钟紫外照射（破坏核酸嘧啶二聚体）。

（3）dUTP-UNG体系：在PCR反应体系中用dUTP替代dTTP，同时加入UNG酶（在预变性阶段60℃孵育5分钟），可特异性降解含dUT