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2025年PCR试题及答案

一、单项选择题（每题2分，共20分）

1.以下关于PCR技术的描述，错误的是（）

A.依赖DNA聚合酶的链式反应

B.需已知目的基因的一段核苷酸序列设计引物

C.扩增产物长度由引物在模板上的结合位置决定

D.变性阶段温度通常为55-60℃

答案：D（变性阶段温度通常为94-98℃，退火阶段为55-60℃）

2.设计PCR引物时，若模板DNA中G+C含量为60%，则引物的Tm值（解链温度）推荐范围是（）

A.45-50℃

B.50-55℃

C.55-65℃

D.70-75℃

答案：C（引物Tm值计算公式常用经验公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)，G+C含量60%时，引物长度通常18-24bp，Tm值多在55-65℃）

3.TaqDNA聚合酶的主要特性是（）

A.具有3→5外切酶活性，可校正错配

B.耐高温（95℃仍保持活性）

C.最适反应温度为37℃

D.只能以RNA为模板合成DNA

答案：B（Taq酶无3→5外切酶活性，无校正功能；最适温度72℃；以DNA为模板）

4.某PCR反应体系中，dNTP浓度过高可能导致的后果是（）

A.引物与模板结合效率降低

B.非特异性扩增减少

C.酶活性被抑制，扩增效率下降

D.产物长度变短

答案：C（dNTP浓度过高会螯合Mg2+，抑制Taq酶活性；同时可能增加错配概率）

5.实时荧光定量PCR（qPCR）中，SYBRGreenⅠ染料的作用原理是（）

A.与双链DNA小沟结合，发出荧光

B.特异性识别目标序列的探针

C.标记引物的5端，通过水解产生荧光

D.与单链DNA结合，激发荧光

答案：A（SYBRGreenⅠ为双链DNA嵌入染料，结合后荧光强度显著增强）

6.以下哪种情况会导致PCR产物出现多条非特异性条带？（）

A.引物浓度过低

B.退火温度过高

C.循环次数过多

D.Mg2+浓度过低

答案：C（循环次数过多会增加非特异性产物的积累；退火温度过高会减少非特异性结合；Mg2+浓度过低可能导致扩增效率下降）

7.进行逆转录PCR（RT-PCR）时，若使用Oligo(dT)引物合成cDNA，其适用的模板是（）

A.原核生物mRNA

B.真核生物mRNA（含polyA尾）

C.病毒双链RNA

D.总RNA中的rRNA

答案：B（Oligo(dT)通过结合真核mRNA的polyA尾启动逆转录）

8.扩增人类基因组中某单拷贝基因时，若模板DNA量极少（1ng），最可能出现的问题是（）

A.产物浓度过高

B.引物二聚体大量形成

C.扩增效率不稳定，结果重复性差

D.退火温度无法准确计算

答案：C（模板量过低时，初始DNA分子数少，可能因随机分布导致扩增失败或结果波动）

9.为验证某PCR扩增产物的特异性，最直接的方法是（）

A.测定产物的OD260/OD280比值

B.进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带大小是否符合预期

C.增加循环次数后再次扩增

D.降低退火温度后重复实验

答案：B（凝胶电泳可通过条带大小初步判断特异性；OD值仅反映核酸纯度和浓度）

10.多重PCR技术的关键要求是（）

A.所有引物的Tm值差异不超过5℃

B.模板DNA必须来自同一物种

C.只能扩增2个目标基因

D.dNTP浓度需低于常规PCR

答案：A（多重PCR需多对引物在同一体系中同时扩增，Tm值接近可保证退火效率一致）

二、简答题（每题8分，共40分）

1.简述PCR技术的基本原理及三步反应的具体过程和作用。

答案：PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA半保留复制原理，通过酶促反应在体外扩增特定DNA片段的技术。基本步骤包括：

（1）变性（Denaturation）：94-98℃加热使双链DNA解链为单链，破坏氢键；

（2）退火（Annealing）：温度降至引物Tm值左右（通常55-65℃），引物与单链模板的互补序列特异性结合；

（3）延伸（Extension）：72℃（Taq酶最适温度）下，TaqDNA聚合酶以dNTP为原料，从引物3端开始沿模板5→3方向合成互补DNA链。

通过25-35次循环，目标DNA片段以指数级扩增。

2.引物设计是PCR实验的关键环节，列举5项引物设计的基本原则，并说明理由。

答案：引物设计的基本原则及理由：

（1）长度18-24bp：过短易非特异性结合，过长则Tm