血红蛋白的提取与分离..pptVIP

第29页，共62页，星期日，2025年，2月5日(2)红细胞的洗涤①洗涤红细胞目的除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少②洗涤操作A、采集血样B、低速短时间离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果）第30页，共62页，星期日，2025年，2月5日C、吸取血浆：上层透明的黄色血浆D、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤E、低速离心（低速短时间）F、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净第31页，共62页，星期日，2025年，2月5日(3)血红蛋白的释放加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白(4)分离血红蛋白溶液①过程将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min第32页，共62页，星期日，2025年，2月5日第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）②试管中溶液层次第33页，共62页，星期日，2025年，2月5日用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体③分离第34页，共62页，星期日，2025年，2月5日取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时(5)透析除去样品中分子量较小的杂质①过程②透析目的第35页，共62页，星期日，2025年，2月5日第36页，共62页，星期日，2025年，2月5日2、凝胶色谱（1）凝胶色谱柱的制作①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平②底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端第37页，共62页，星期日，2025年，2月5日底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底注意事项：⑤安装其他附属结构③顶塞的制作打孔安装玻璃管④组装将上述三者按相应位置组装成一个整体第38页，共62页，星期日，2025年，2月5日第39页，共62页，星期日，2025年，2月5日（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择A、材料“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克B、代表意义：交联葡聚糖凝胶（G-75）第40页，共62页，星期日，2025年，2月5日配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液②凝胶的前处理③凝胶色谱柱的装填方法A、固定B、装填将色谱柱处置固定在支架上将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀第41页，共62页，星期日，2025年，2月5日注意：2、装填凝胶柱时不得气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙第42页，共62页，星期日，2025年，2月5日第43页，共62页，星期日，2025年，2月5日1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果注意：2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时④洗涤平衡第44页，共62页，星期日，2025年，2月5日第1页，共62页，星期日，2025年，2月5日(一）蛋白质占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物2、组成元素C、H、O、N一、基础知识1、含量3、相对分子质量高分子化合物第2页，共62页，星期日，2025年，2月5日4、基本组成单位氨基酸5、氨基酸通式RHCCOOHNH26、氨基酸连接方式脱水缩合第3页，共62页，星期日，2025年，2月5日8、分子结构7、肽键CONH氨基酸肽链蛋白质脱水缩合盘曲折叠（一条或者多条）第4页，共62页，星期日，2025年，2月5日10、生理功能细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组织更新的主要原料，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是一切生命活动的主要承担者氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结