无细胞及全细胞催化高效合成乙偶姻的研究.pdfVIP

摘要

乙偶姻，又名3-羟基2-丁酮，广泛应用于食品、医药、农业及化工领域。本

文分别构建和优化了以2,3-丁二醇、甲醛和丙酮酸为底物的无细胞催化体系，以

及丙酮酸和乳酸为底物的全细胞催化体系，探究了上列体系高效合成乙偶姻的潜

力。

首先构建了由meso-2,3-丁二醇脱氢酶和NADH氧化酶组成的双酶催化体系，

通过筛选不同来源的NADH氧化酶（NOX）及温度、pH、NOX添加量等反应条

件的优化实现了meso-2,3-丁二醇向乙偶姻的高效转化。该体系利用425.4mM

meso-2,3-丁二醇生产了399.7mM（35.20g/L）(3R)-乙偶姻，手性纯度达到95.6%，

乙偶姻得率达到理论值的95%。乙偶姻产量和meso-2,3-丁二醇转化率均为同类

型催化体系中的较高值。

接着本研究设计和构建了以一碳化合物甲醛为底物生产乙偶姻的无细胞多

酶催化体系，包括甲醛利用途径，糖酵解途径和乙偶姻合成途径三个模块。经过

反应体系优化后，该体系可利用122mM甲醛合成20.17mM的乙偶姻，得率高

达0.165mol/mol，达到理论得率的99.0%。首次实现利用无细胞多酶催化体系转

化甲醛生产乙偶姻，为利用廉价一碳化合物生产高附加值的乙偶姻奠定了基础。

在课题组前期构建的丙酮酸为底物的无细胞催化体系基础上，本文通过酶添

加量及反应条件的优化直接催化4500mM的高浓度丙酮酸钠合成了2198.9mM

(186.7g/L)的乙偶姻，得率达到0.472mol/mol。随后，基于刚化柔性位点的方法

对关键酶α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)进行蛋白质工程改造以提高其稳定性，得到

稳定性有不同程度提高的三个单突变体：A4（ALDCE248A），A12（ALDCK115G）

和C6（ALDCD167A），以及组合的双突变体A4-C6（ALDCE248A-D167A）和三突变

体A4-A12-C6（ALDCE248A-K115G-D167A）。将所有突变体应用于丙酮酸为底物的催

化体系中，结果显示突变体A4-A12-C6催化生成的乙偶姻产量比野生型高

19.57%。突变体A4-A12-C6催化4500mM丙酮酸时，(3R)-乙偶姻的产量达到

195.6g/L，得率达到理论值的98.6%（0.493mol/mol），均为目前已报道的无细胞

催化法的极高水平。

最后，为降低乙偶姻生产的成本，本文以大肠杆菌为底盘构建了以丙酮酸为

底物的全细胞催化体系，并在该体系基础上进一步将底物由丙酮酸扩展到更为廉

价的乳酸。最优菌株BL-6展现了最高的乙偶姻合成效率，可催化4000mM丙酮

酸生产1750mM乙偶姻，乙偶姻得率达到0.444mol/mol。随后，构建了以乳酸

为底物的合成途径，经过对全细胞催化条件的优化及底盘细胞中乙酸合成途径的

敲除，使乙偶姻对乳酸的得率由0.108mol/mol显著提升至0.420mol/mol。通过

乳酸底物的连续流加，最优菌株BL-12在生物反应器中的乙偶姻产量达到649.0

mM(57.18g/L)，得率高达0.484mol/mol，为理论值的96.8%。本研究首次构建

了转化乳酸生产乙偶姻的全细胞催化体系，且乙偶姻的产量达到以乳酸为底物的

较高水平。

本研究基于所构建的无细胞及全细胞催化体系深入探究了不同底物生产乙

偶姻的效率，这些体系及催化工艺为重要平台化学品乙偶姻的绿色生物制造提供

了新的可行方案。

关键词：乙偶姻，无细胞催化法，全细胞催化法，蛋白质工程，meso-2,3-丁二醇，

甲醛，丙酮酸，乳酸。

ABSTRACT

Acetoin,3-hydroxy-2-butanone,hasalsobeenwidelyusedinfood,cosmetic,

agriculturalandchemicalindustries.Inthiswork,cell-freebiocatalyticsystemswith

2,3-butanediol,formaldehydeorpyruvat