鰤鱼诺卡氏菌kasB基因在菌体脂类代谢及致病过程中的作用研究.pdfVIP

鰤鱼诺卡氏菌kasB基因在菌体脂类代谢及致病过程中的作用研

究

摘要

鰤鱼诺卡氏菌（Nocardiaseriolae）是一种严重危害我国淡、海水鱼类养殖

的重要病原菌，可导致以内脏肉芽肿或白色结节为主要症状的鱼类诺卡氏菌

病，给水产养殖业带来巨大的经济损失。目前针对鱼类诺卡菌病的防治主要以

化学药物为主，然而化学防治的用药周期长、成本高、疗效差。尽管如此，有

关鱼类诺卡氏菌病的免疫防治的研究非常薄弱，目前还没有针对该病的商品化

疫苗。目前国内外对鰤鱼诺卡氏菌的研究主要集中在细菌分离鉴定、诊断技

术、组织病理等方面，而对鰤鱼诺卡氏菌的致病因子以及致病机制等方面的研

究仍处于起步阶段。分枝菌酸（Mycolicacids，MASs）是棒状杆菌、分枝杆菌

和诺卡氏菌等放线菌目细菌所特有的细胞壁组分，该组分对稳定胞壁结构、维

持其致密性等起着关键作用，并与细菌的生长、存活、毒力和耐药性密切相

关。β-酮酰基-酰基载体蛋白（Acylcarrierprotein，ACP）合成酶（KasA/B）是

分枝杆菌属细菌合成分枝菌酸的必需酶之一，是抗结核新药开发的重要靶点之

一。本研究在鰤鱼诺卡氏菌基因组中鉴定到1个kasB同源基因（kasB），该基

因编码的蛋白与结核分枝杆菌Kas同源度高达63.20%。通过构建含有kasB基因

上下游同源臂的pK18mobSacB重组自杀质粒，并利用同源重组的方法获得了

kasB基因无痕缺失株ΔkasB。通过比较鰤鱼诺卡氏菌亲本株与缺失株的体外生

长速度、细胞壁超微结构、对不同药物的敏感性以及菌体全脂质组研究kasB基

因在鰤鱼诺卡氏菌细胞壁结构以及细菌细胞壁脂类合成过程中的作用；以大黄

鱼头肾细胞系及大口黑鲈作为研究模型，通过比较鰤鱼诺卡氏菌亲本株与缺失

株对细胞侵入和存活能力以及对鱼类的致病力研究kasB基因在鰤鱼诺卡氏菌致

病过程中的重要作用。

通过细菌生长曲线测定，结果表明，与鰤鱼诺卡氏菌野生株相比，ΔkasB生

长速率显著下降，该结果表明kasB基因可能参与鰤鱼诺卡氏菌生长的相关代谢

过程。革兰氏染色和抗酸染色结果显示，kasB基因的缺失对鰤鱼诺卡氏菌的菌

体形态，革兰氏染色以及抗酸性染色结果均没有影响，该结果表明kasB基因的

缺失不影响鰤鱼诺卡氏菌的肽聚糖和分枝菌酸结构。通过琼脂扩散法比较了WT

菌株和ΔkasB缺失株对氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类和大环内酯类等11种

药物的耐药性，发现kasB基因的缺失增加了鰤鱼诺卡氏菌对一些亲脂性抗生素

如强力霉素、红霉素和氯霉素的敏感性。通过透射电子显微镜对细胞超微结构

进行观察发现，与WT菌株相比，ΔkasB菌株的细胞壁更厚，主要是因为缺失株

细胞壁中的肽聚糖层与多糖层之间存在较宽的低电子密度区域（细胞壁脂质

层）。

菌体全脂质组学分析结果显示，N.seriolaeXSYC-NsWT和ΔkasB菌株中

均鉴定到37种脂质亚类共1726种脂质分子，主要为甘油磷脂类和固醇类脂

质。两株菌的脂质种类相同且脂类总含量无显著差异，分析结果显示，WT菌株

中甘油磷脂类、鞘脂类、甘油酯类、固醇类和脂肪酰类脂质分别占比43.13%、

3.21%、2.34%、42.92%和8.40%，ΔkasB菌株中占比分别为55.91%、3.41%、

3.07%、34.63%和2.98%。比较脂质组学分析结果显示，共有73种脂质分子含

量发生显著变化，与野生型菌株相比，ΔkasB菌株中包括LPC、Hex1Cer、TG、

OAHFA等大部分脂质分子含量显著增加，