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PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析（原理、操作与结果解读）

一、核心原理：为什么用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物？

琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定PCR产物的经典技术，核心基于分子大小与电荷差异实现分离：

电荷驱动：PCR产物（DNA片段）带负电，在电场中会向正极移动，移动方向与分子大小无关；

凝胶筛分：琼脂糖形成多孔网状结构，分子越小的DNA片段越易穿过凝胶孔隙，移动速度越快；分子越大则受阻越明显，移动速度越慢；

可视化与定量：通过溴化乙锭（EB）或SYBRGreen等荧光染料嵌入DNA双链，在紫外灯下可观察到荧光条带，结合DNAMarker（已知大小的标准片段）可判断PCR产物的分子量，通过条带亮度可初步半定量产物浓度。

简言之，该技术可快速验证PCR产物的有无、大小正确性、纯度（是否有非特异性扩增），是PCR实验后续分析（如克隆、测序）的关键前置步骤。

二、实验操作流程：从凝胶制备到结果观察

（一）试剂与器材准备

核心试剂：琼脂糖（根据产物大小选择浓度，如1%-2%）、1×TAE电泳缓冲液（或TBE，TAE缓冲能力更强，适合长时间电泳）、DNAMarker（如DL2000，包含100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp片段）、6×LoadingBuffer（含溴酚蓝、二甲苯青等指示剂，用于追踪电泳进度，且能增加样品密度使DNA沉入加样孔）、荧光染料（如10000×SYBRGreen，电泳前加入凝胶或电泳后染色）；

器材：电泳槽、梳子（决定加样孔大小，常用10μL或20μL规格）、微波炉（加热溶解琼脂糖）、紫外凝胶成像系统、移液器（10μL/20μL）、离心管。

（二）详细操作步骤（以1%琼脂糖凝胶为例，分析200-2000bpPCR产物）

1.琼脂糖凝胶制备（关键：浓度匹配产物大小）

称取琼脂糖：根据电泳槽大小计算凝胶体积（如小型槽需50mL），称取0.5g琼脂糖（50mL×1%=0.5g），放入锥形瓶中；

溶解琼脂糖：加入50mL1×TAE缓冲液，轻轻摇匀后放入微波炉，中高火加热1-2分钟（期间取出摇晃1次，避免局部过热爆沸），直至琼脂糖完全溶解（溶液澄清无颗粒）；

加入荧光染料：待凝胶温度降至50-60℃（手感不烫手），加入5μL10000×SYBRGreen（终浓度1×），轻轻颠倒混匀（避免产生气泡，气泡会导致条带变形）；

倒胶与插梳：将溶解好的凝胶倒入电泳槽（提前清洁干燥，两端用胶带密封），放入梳子（梳齿底部距槽底1-2mm，避免DNA片段从底部漏出），室温静置30-40分钟，待凝胶完全凝固（呈乳白色不透明状）。

2.样品制备与加样（避免交叉污染与样品溢出）

PCR产物与LoadingBuffer混合：取5μLPCR产物（根据条带亮度调整，浓度高可减少至2-3μL），加入1μL6×LoadingBuffer，轻轻吹吸混匀（避免剧烈震荡导致DNA断裂）；

加样操作：移除电泳槽两端的胶带，将凝固的凝胶连同槽放入电泳仪（注意正负极：加样孔端接负极，另一端接正极，DNA向正极移动），向电泳槽中加入1×TAE缓冲液，直至液面没过凝胶表面1-2mm；用移液器将混合好的样品缓慢加入加样孔（第一孔加5μLDNAMarker，其余孔加样品，避免枪头刺破凝胶或样品溢出污染相邻孔）。

3.电泳运行（控制电压与时间，避免条带扩散）

设定参数：小型电泳槽通常选择80-100V电压（电压过高会导致凝胶发热，条带扩散；电压过低则耗时过长），电泳时间20-30分钟（观察指示剂：溴酚蓝移动至凝胶1/2-2/3处即可停止，避免小分子片段跑出凝胶）；

启动电泳：盖好电泳仪盖子，打开电源，确认电流正常（通常100V下电流约30-50mA），期间避免触碰电泳槽（防止触电）。

4.结果观察与成像（紫外防护，避免染料淬灭）

紫外成像：关闭电泳仪电源，取出凝胶，放入紫外凝胶成像系统（选择254nm或302nm波长，254nm分辨率高，适合精确判读；302nm对DNA损伤小，适合后续回收）；

成像与记录：调整曝光时间（通常0.5-2秒），直至条带清晰无背景杂光，保存图片（建议保存为JPG或TIFF格式），记录Marker条带位置与样品条带位置、亮度、数量。

三、结果判读：从条带看PCR实验成败

（一）理想结果：单一清晰条带

条带位置：与预期产物大小一致（如目标片段500bp，样品条带应与DNAMarker中500bp条带对齐），说明PCR扩增正确，无明显大小偏差；

条带亮度：与Marker中相近