酶反应的底物三个必要试剂.pptVIP

EMIT示意图CEDIA示意图分类：液相酶免疫测定固相酶免疫测定以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最为常用的固相酶免疫测定非均相酶免疫测定

heterogeneousenzymeimmunoassay与均相不同之处需分离游离与结合的酶标记物第三节酶联免疫吸附试验ELISA

enzyme-linkedimmunosorbentassay底物显色定性或定量的分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234ELISA方法类型及反应原理固相的抗原或抗体酶标记物（酶结合物）酶反应的底物三个必要试剂ELISA检测抗原的方法双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等*********第一节酶免疫技术的特点放射免疫技术荧光免疫技术酶免疫技术三大经典标记技术三大经典标记技术主要试剂:酶标记的抗体或抗原酶标物特点：免疫学活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性原理及特点特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析原理及特点酶和酶作用底物标记酶的要求：活性高性质稳定专一性强酶催化底物的显色信号易于判断和测量方法敏感，重复性好，简单易行酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉酶和酶作用底物辣根过氧化物酶（HRP）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心RZ值：403nm（辅基）与275nm（主酶）OD值之比RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要ELISA中应用最为广泛的标记用酶常用酶酶和酶作用底物碱性磷酸酶（AP）菌源性AP肠粘膜APβ–半乳糖苷酶（β-Gal）用于均相酶免疫测定常用酶酶和酶作用底物HRP的底物DH2+H2O2→→→D+2H2OHRP供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高常用底物酶和酶作用底物HRP的常见底物邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTS常用底物OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。酶和酶作用底物HRP的常见底物酶和酶作用底物AP的底物β-Gal的底物对-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。常用底物酶标记抗体或抗原酶免疫技术的核心组成部分酶结合物（conjugate）酶标记物通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物酶标记抗体或抗原抗原要求纯度高，抗原性完整抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。制备方法要求酶标记抗体或抗原制备方法要求技术方法简单、产率高，重复性好标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性酶标记物稳定，不形成聚合物酶标记抗体或抗原制备方法过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标记抗体或抗原戊二醛交联法酶标记抗体或抗原戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。固相载体固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法