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传统发酵蔬菜中微生物多样性的研究方法文献综述

对于传统发酵蔬菜中微生物的研究方法主要分为基于传统分离培养的培养依赖型方法和基于分子生物学技术的非培养依赖型两大类。

传统分离培养方法主要是是采用平板涂布、分离、鉴定等方法来研究传统发酵蔬菜中微生物种类的方法。早期国内外学者关于传统发酵蔬菜中微生物种类的研究多采用此方法，菌株的鉴定主要依赖于传统的表型和生理生化方法[44]。然而，该方法依赖于对菌株的分离培养纯化，实验周期长且费时费力，同时，菌株的鉴定仅仅通过糖发酵模式和细胞形态等表型，极有可能导致错误的鉴定，对于菌种精确分类鉴定易造成失误[45]。随着分子生物学的飞速发展，微生物的分类、鉴定已不再局限于仅仅使用传统生理生化特征等方法，以16SrDNA基因序列分析技术为代表的新型分子生物学技术也相继被应用于微生物的分类和鉴定中，在微生物的分类研究中发挥了至关重要的作用[46]。基于传统分离培养方法，国内外学者从传统发酵蔬菜中分离筛选出了L.plantarum、L.acidophilus、L.casei、L.paracasei、L.reuteri、L.pentosus、L.fermentium和Leu.mesenteroides等多种乳酸菌，使人们对传统发酵蔬菜中的微生物多样性有了初步的了解和认识。然而，尽管传统分离培养技术已经发展了几十年，但由于人们对绝大多数自然界中的微生物还没有掌握合适的培养基和生长条件[47]，并且传统发酵食品中有很多微生物在实验室条件下通过常规纯培养方法很难获得，采用传统分离培养方法总是会重复筛选到相同的微生物。因此，依赖于纯培养的传统分离培养方法受主观因素影响较大，并不能真实反应参与蔬菜发酵的微生物群落的多样性，大大限制了人们对发酵蔬菜等传统发酵食品复杂体系及其发酵机理的认识。

传统分离培养技术操作周期长，且不能真实反映整个发酵体系中的微生物多样性。近年来，逐步发展起来的分子生物学技术克服了分离培养方法的不足，可以更准确、快速地获得环境样品中各种微生物的菌落指纹和特征性核苷酸序列，在确定微生物的多样性及其分类地位方面有着不可比拟的优势，目前已逐渐发展成为复杂自然环境中微生物群落的主流研究方法，如PCR-DGGE[48,49]和SSCP-PCR[50]等。但对于传统发酵蔬菜中多菌种的复杂体系，这些方法存在通量小、分辨能力低、背景噪声影响大和条带分析困难等问题，也同样难以快速全面的反应发酵蔬菜中的微生物群落结构[45]。随着第二代测序技术的发展，尤其是基于环境DNA随机测序的全自动高通量测序平台，为包括发酵蔬菜在内的传统发酵食品中微生物多样性研究开启了新的研究热潮。高通量测序技术在快速分析环境中的微生物群落、发掘重要未知微生物等方面具有显著优势[51]。作为一个复杂的食品生态体系，采用高通量测序方法揭示参与蔬菜发酵的微生物群落多样性及其消长规律已经成目前的研究热点[52–54]，基于illumina测序平台的二代测序技术已在包括四川泡菜、东北酸菜、西北浆水等在内的多种传统发酵蔬菜制品微生物菌系结构的研究中得到了广泛的应用，大大提升了我们对这些发酵蔬菜复杂微生物环境的认知水平[33,55–59]。然而，现有的高通量测序技术在具备提供丰富和全面信息优势之外，也存在局限性。由于其主要是基于细菌16SrDNAV3~V4区域以及真菌rDNA基因间隔区ITS区域对微生物菌群结构多样性进行分析比对，在扩增序列长度和测序深度方面都有一定的局限性，这种局限性很可能导致对既有微生物群落多样性近乎错误的描述。因此，目前在对复杂环境中微生物菌系结构分析方面，多采用传统分离培养法与高通量测序相结合，最终通过两种方法共同解释发酵样品的微生物群落多样性，有助于更加全面的解析传统发酵食品体系中的微生物多样性[59-61]。

参考文献

[1]BekeleAZ,KoikeS,KobayashiY.GeneticdiversityanddietspecificityofruminalPrevotellarevealedby16SrRNAgene-basedanalysis[J].FemsMicrobiologyLetters,2010,305(1):49-57.

[2]SinghSA,SinghHD,NongmaithemR,etal.Biochemicalcompositionofaoibum-afermentedbambooshootanditsdynamicsduringfermentationinrealtimemodel[J].InternationalConferenceonFoodEngineer