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N-乙酰氨基葡萄糖苷酶及其壳聚糖纳米材料固定化酶：抗细菌生物被膜的作用机制与应用前景

一、引言

1.1研究背景

细菌生物被膜（BacterialBiofilm）是细菌为适应生存环境，附着于物体表面，分泌胞外多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等多糖蛋白复合物，将自身克隆聚集包绕其中形成的膜状物。这一特殊结构广泛存在于自然环境中，无论是医疗设备表面、食品加工器械，还是人体组织内部，都能发现细菌生物被膜的踪迹。

细菌生物被膜给人类生活带来了诸多严重问题。在医疗领域，据美国国立卫生研究院（NIH）调查公告显示，超过80%的细菌性感染与生物被膜有关。例如，导尿管相关尿路感染、人工关节感染、肺部感染等，这些由生物被膜细菌引发的感染往往反复发作且难以治愈。生物被膜中的细菌比浮游细菌具有更强的抗生素耐药性，耐药程度可高达100-1000倍，使得传统抗菌药物难以发挥作用，增加了临床治疗的难度和成本，严重威胁患者的健康和生命安全。在食品工业中，食源性致病菌和腐败菌形成的生物被膜不仅会造成设备的腐蚀，还会通过残留、接触等方式污染食品，影响食品的质量和安全，引发食源性疾病，给食品企业带来经济损失的同时，也危害了消费者的身体健康。

面对细菌生物被膜带来的严峻挑战，研发有效的抗生物被膜方法已迫在眉睫。传统的抗菌策略在应对生物被膜细菌时效果不佳，因此需要探索新的途径。酶作为一种高效、特异性强的生物催化剂，在抗细菌生物被膜领域展现出了潜在的应用价值。其中，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶因其能够作用于细菌生物被膜的关键组成成分，成为研究热点之一。同时，纳米材料技术的发展为酶的固定化提供了新的思路和方法，壳聚糖纳米材料因其独特的性质，在固定化酶方面具有显著优势，有望进一步提高酶的性能和抗生物被膜效果。

1.2N-乙酰氨基葡萄糖苷酶研究现状

N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（N-acetylglucosaminidase，NAG）是一种能够水解β-N-乙酰氨基葡萄糖苷键的酶，广泛存在于各种组织器官、体液、血细胞中，是溶酶体中的一种酸性水解酶。从结构上看，NAG是一种球形四亚基的蛋白质，每个亚基之间通过二硫键相连接。这种结构赋予了它一定的稳定性和功能特性。在特性方面，NAG在高pH值和低离子浓度下具有活性，在低温下可以被稀释，且对直链三糖苷酶以及丝氨酸蛋白酶不敏感。其底物专一性分析结果表明该酶能特异性降解β-1，6-N-乙酰葡聚糖胺等相关底物。

在抗细菌生物被膜领域，NAG的研究取得了一些初步成果。研究发现，某些NAG能够特异性地降解细菌生物被膜中的关键多糖成分，如β-1，6-N-乙酰葡聚糖胺，从而破坏生物被膜的结构和稳定性。中国海洋大学的研究人员从黄海海泥样品中筛选到一株高产N-乙酰葡萄糖苷酶的菌株假交替单胞菌（Pseudoa]teromonassp。）QY403，并从中分离纯化得到N-乙酰葡萄糖苷酶NagY1。该酶对伴放线放线杆菌生物膜形成具有显著的抑制作用（50%），并且对已形成生物膜的清除率为74.5%。然而，目前对于NAG抗细菌生物被膜的作用机制还尚未完全明确，其在实际应用中也面临着一些问题，如酶的稳定性、活性保持以及大规模生产等。

1.3壳聚糖纳米材料固定化酶概述

壳聚糖是一种来源广泛、生物相容性好、生物降解性能优良的天然高分子，其化学名称为聚氨基葡萄糖。壳聚糖分子中含有大量的氨基和羟基等活性基团，这些基团使其能够与生物分子发生作用，从而被广泛应用于固定化生物分子领域。壳聚糖纳米材料是将壳聚糖制备成纳米级别的颗粒或结构，其具有比表面积大、吸附能力强、生物活性高等优点。

将酶固定在壳聚糖纳米材料上形成壳聚糖纳米材料固定化酶，具有诸多优势。首先，壳聚糖纳米材料的高比表面积能够增加酶的负载量，提高单位质量载体上酶的活性。其次，固定化过程可以保护酶的活性中心，减少外界环境因素（如温度、pH值、蛋白酶等）对酶活性的影响，从而提高酶的稳定性。固定化酶还便于回收和重复利用，降低了使用成本，有利于实现工业化应用。

常用的制备壳聚糖纳米材料固定化酶的方法有交联法和包埋法等。交联法是借助多功能试剂（如戊二醛等）使游离酶的氨基酸残基与双官能团或多官能团交联剂反应而发生交联，从而将酶固定在壳聚糖纳米材料上。包埋法是将酶包埋在壳聚糖纳米材料的多孔载体中，使酶固定。这种方法制备工艺简便且条件较为温和，载体不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，可获得较高的酶活力回收率。目前，壳聚糖纳米材料固定化酶在生物医学、食品工业、环境保护等领域都有一定的研究和应用。在生物医学领域，用于制备固定化凝血酶等，探究其在血凝方面的应用；在食品工业中，可用于食品保鲜、酶